《ACR Open Rheumatology》：A Combined Transcriptomics and Proteomics Approach to Identify Immune Signatures in ANCA-Associated Glomerulonephritis
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目的：抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关性血管炎常导致严重肾损伤。为更好地理解ANCA相关性肾小球肾炎（AAGN）并识别潜在的新治疗靶点，研究人员对转录组学队列中的23名患者、蛋白质组学队列中的10名患者以及每次比较的5名健康对照的肾活检组织进行了全面的转录
目的：抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关性血管炎常导致严重肾损伤。为更好地理解ANCA相关性肾小球肾炎（AAGN）并识别潜在的新治疗靶点，研究人员对转录组学队列中的23名患者、蛋白质组学队列中的10名患者以及每次比较的5名健康对照的肾活检组织进行了全面的转录组学和分区蛋白质组学分析。
方法：对福尔马林固定石蜡包埋的肾活检组织进行批量RNA测序。使用DESeq2、Ingenuity Pathway Analysis和基因集富集分析（GSEA）识别差异表达基因和通路。评估基因表达与组织学特征之间的相关性。通过激光显微切割的肾小球和肾小管间质区室的质谱分析进行蛋白质组学分析，以识别差异丰度蛋白和富集通路。
结果：在AAGN中，与对照组相比，有347个基因上调，134个下调，包括IL17D、CXCR2、IL7R和CD163。值得注意的是，多个三结构域（TRIM）家族基因上调。GSEA揭示了广泛的免疫细胞富集和促炎性白细胞介素（IL）-12、IL-17和IL-18信号通路的激活。此外，特定通路与组织学特征相关（r ≥ 0.6），包括组织学正常肾小球中补体级联的富集，提示补体激活先于可见的结构损伤。相反，STAT3/TRIM25信号通路与肾小球硬化相关，IL-23与坏死性肾小球相关，FAT10（UBD）信号通路与间质纤维化和肾小管萎缩相关。蛋白质组学在肾小管间质中识别出63种差异丰度蛋白，在肾小球中识别出271种，关键网络激活因子在数据集间重叠。
结论：本研究揭示了AAGN中复杂的肾内免疫景观，其特征包括多种免疫细胞参与以及进行性损伤相关的通路。研究结果突出了潜在的治疗靶点，包括IL-17、IL-8和IL-23，值得进一步研究。
论文解读文章
研究背景
抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）是一种罕见、严重的自身免疫性疾病，以中小血管坏死性炎症和/或肉芽肿性组织炎症为特征。肾脏常受累，导致快速进展性肾小球肾炎，即ANCA相关性肾小球肾炎（AAGN），表现为血尿、蛋白尿和加速性肾衰竭。尽管现有治疗手段有所进步，但AAGN的预后仍不乐观：诊断后五年内终末期肾病（ESKD）发生率约为20%至28%，发生ESKD的患者五年死亡率高达47%。此外，AAGN在移植后复发风险较高，对移植物存活构成显著威胁。目前对驱动AAGN肾脏疾病的分子通路认知存在空白，且缺乏充足的肾组织测序数据集。因此，研究人员开展了这项研究，旨在通过整合转录组学和蛋白质组学分析，全面揭示AAGN肾活检组织中的免疫特征，识别差异表达基因（DEGs）、蛋白和分子通路，并评估免疫细胞浸润情况，为发现新的治疗靶点提供依据。该研究论文发表在《ACR Open Rheumatology》。
主要关键技术方法
研究人员从美国俄亥俄州立大学纳入23例AAGN患者（21例新诊断、2例复发）的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾活检组织，以5例健康供肾组织为对照进行转录组学分析；另从其中10例患者及5例健康对照（2例重叠）进行蛋白质组学分析。关键技术包括：1）批量RNA测序，使用DESeq2识别DEGs，Ingenuity Pathway Analysis（IPA）和基因集富集分析（GSEA）进行通路分析；2）激光显微切割分别分离肾小球和肾小管间质（TI）区室，通过液相色谱-串联质谱进行蛋白质组学分析；3）Spearman相关性分析评估基因表达与Berdon分类组织学特征（正常、硬化、新月体/坏死性肾小球、间质纤维化/肾小管萎缩）之间的关联；4）利用狼疮肾炎加速医学伙伴联盟（AMP）的单细胞RNA-seq参考数据集进行GSEA预测免疫细胞浸润。
研究结果
1. 差异表达分析
主成分分析（PCA）显示血管炎患者与健康对照明显分离，但不同AAV临床表型间无显著聚类。批量RNA测序鉴定出481个显著DEGs（|log2倍变化|≥1.5，校正P<0.05），其中347个上调、134个下调。上调基因包括多种白细胞介素（IL）及受体，如IL17D、LILRA4、NFKBIL1、CXCR2、IL24、IL7R，以及免疫细胞表面标志物CD163、CD19、CD244、CD48、CD6。三结构域（TRIM）家族基因（TRIM25、TRIM35、TRIM37）显著上调，而抗炎受体IL10RA下调。
2. 分区蛋白质组学特征
对激光显微切割的肾小球和TI区室分别进行蛋白质组学分析，分别鉴定出271种和63种差异丰度蛋白（DAPs）。TI区室以免疫和急性期激活为主，包括补体成分C3、C4A、C4B上调，免疫球蛋白κ链蛋白提示局部B细胞活化，以及7种纤维化相关蛋白（FGA、FGB、FGG、TGM2、S100A1、S100A10、LRG1）上调，同时肿瘤坏死因子（TNF）-α诱导蛋白2、关键干扰素（IFN）信号转录因子STAT1和急性期蛋白Serpin A3、Orosomucoid 1升高。肾小球蛋白质组学显示严重炎症损伤和滤过屏障破坏：补体C3、C4A、C4B上调，同时补体调节因子CFH升高（可能为代偿不足）；ITGAM（CD11b）和多种免疫球蛋白重链/轻链上调提示白细胞募集和B细胞活性；关键足细胞结构蛋白nephrin、podocalyxin、dystroglycan 1和cubilin下调，直接将免疫信号与肾小球基底膜损伤联系起来。
3. IPA分析（转录组与蛋白质组）
IPA识别出多个保守和特有的经典通路。中性粒细胞脱颗粒和先天-适应性免疫细胞通讯在所有数据集中均显示高度激活。TRIM21细胞内抗体信号通路和I类主要组织相容性复合体（MHC）介导的抗原加工在所有区室中持续激活。IFN-γ和IFN-α/β信号在转录组和两个蛋白质组区室中均显著激活。补体级联和B细胞受体（BCR）信号全局激活，但II类MHC呈递在转录组和TI中激活，在肾小球中预测抑制。趋化因子信号在转录组中激活，但在蛋白水平上TI和肾小球均预测抑制，提示转录后调控或蛋白快速消耗。重要的是，PD-L1检查点通路在TI和肾小球中均预测抑制，表明局部免疫耐受破坏。
4. 免疫细胞富集分析
GSEA预测单核细胞、巨噬细胞和B细胞显著富集，而调节性T细胞无显著富集。交叉参考DAPs与免疫细胞标志物，发现TI区室与免疫细胞标志物的一致性更高，提示该区室的免疫特征是主要驱动因素。
5. 转录组数据与组织学相关性
Spearman相关性分析（rho≥0.6，校正P<0.05）发现：74个基因与正常肾小球百分比相关。正相关基因涉及自身免疫（IL1R1、DNASE1、CLU等）和纤维化（CLU、CALML3、ARHGAP5）；负相关基因涉及补体/炎症（C1S、S100A10等）、适应性免疫（T细胞受体基因、GZMA等）和先天免疫信号（TICAM1、SIGLEC1、TRIM22等）。补体级联通路与正常形态负相关，提示分子激活先于可见新月体形成。58个基因与硬化肾小球百分比相关，正相关涉及纤维化/组织重塑（SLIT3、GATA6等）和凋亡/自噬，负相关涉及纤维化调节（DACT2、ARHGEF11）和免疫信号（IL1R1、IL12RB2、SASH1），关键通路包括STAT3和Myc介导的凋亡信号，上游调节因子包括TRIM25和IKZF1。91个基因与新月体/坏死性肾小球百分比相关，正相关涉及T细胞功能（IL12RB2、GADD45G、TRAF6、BCL6）、巨噬细胞/单核细胞功能（CTSH、SLC15A3、LILRA2、ADAM8）、树突状细胞功能（NLRP7、TRAF）和NK细胞功能（FCGR3A），负相关包括SPI1，关键通路为IL-23信号、NK细胞信号和IL-12信号，上游调节因子包括IL-10、IL-2和IL-18。63个基因与间质纤维化/肾小管萎缩（IFTA）百分比相关，正相关涉及纤维化/细胞外基质重塑（EDIL3、GPR132等）和免疫信号（TREML2、GPR132、IGHV1-46等），负相关涉及免疫信号（IL1R1、RFXANK等），关键通路为FAT10（UBD）信号和I类MHC介导的抗原加工。
6. 蛋白质组数据与组织学相关性
蛋白质组相关性分析结果与转录组一致。4949个肾小球蛋白与正常肾小球百分比显著相关，富集通路包括IL-8、IL-1、IL-6和IL-17A，IL-10信号下调，关键上游调节因子包括TNF、PPARG、IFN-γ和PPARA。231个蛋白与坏死性肾小球百分比显著相关，上调通路包括IL-1、IL-8、IFN-γ信号和TNFR2非经典NF-κB信号，关键通路为中性粒细胞脱颗粒和EIF2信号。415个蛋白与硬化肾小球百分比显著相关，富集通路包括IFN-α/β信号、IL-33、IL-1、IL-27和IL-17F，激活上游调节因子包括TGB1和IL-1β，PPARGC1下调。
讨论与结论
研究人员发现转录组和蛋白质组在单个分子水平上重叠有限，但通路水平高度一致，如TRIM21细胞内抗体信号、IL-13信号、补体级联和S100信号在所有组学层和区室中保守，增强了这些通路在AAGN中生物学相关性的可信度。补体激活尤为突出，其与组织学正常肾小球的相关性提示补体失调可能是先于可见组织损伤的早期事件，支持早期使用补体靶向策略（如C5a受体抑制）。免疫细胞浸润方面，单核细胞是肾内最富集的细胞类型，B细胞受体和系统性红斑狼疮信号通路激活为利妥昔单抗等B细胞清除疗法的有效性提供了机制支持。IL-17和IL-23信号提示Th17效应细胞在促进肾小球炎症中起关键作用，结合STAT3和TRIM25上调，支持探索IL-17/IL-23阻断（如ustekinumab）在AAGN中的应用。最关键的发现是TRIM蛋白（特别是TRIM21和TRIM25）的持续上调，研究人员提出这是一种此前未报道的免疫轴，连接先天免疫与免疫介导的组织损伤。STAT3/TRIM25与肾小球硬化相关，FAT10信号与IFTA相关，为组织学指导的精准靶向治疗奠定了基础。此外，PD-L1检查点通路在TI和肾小球中均预测抑制，提示局部免疫耐受失败可能通过髓系检查点功能缺陷导致持续炎症。
结论：这项整合性转录组学和蛋白质组学分析识别出补体、细胞因子（TNF-α、IL-17/IL-23和IFN）和抗体信号是AAGN中驱动疾病的主要免疫程序，同时揭示了一个新的TRIM介导的免疫轴和空间限制性调节机制。这些发现为开发更精准的靶向治疗——包括补体抑制、细胞因子阻断和免疫检查点调节——以减轻AAGN肾损伤提供了框架。
