基于DLP的光遗传学系统中寄生光的光学与功能特性分析，用于单神经元控制

《Journal of Neuroscience Methods》：Optical and functional characterization of parasitic light in a DLP-based optogenetic system for single-neuron control

　　•寄生光会降低分辨率，并引发非预期的神经网络激活。•DLP的黑色水平值及背向反射是导致非预期照明的主要来源。•亚阈值强度会改变神经网络活动，进而影响可塑性检测结果。•采取相应的缓解策略可以提高靶向精度和实验的可靠性。

引言
光遗传学通过光来调节神经元活动，其特异性依赖于目标光敏蛋白（视蛋白）的基因表达（Yizhar等人，2011年）。通过以特定的空间模式施加激发光，可以进一步提升这种精确度，从而实现对表达视蛋白的特定细胞群的选择性激活（Ronzitti等人，2017年；Anselmi等人，2015年）。在体内和体外实验中，人们采用了多种光学技术和设备，包括空间光调制器、数字微镜装置、LED阵列以及激光扫描技术，这些技术能够生成分辨率达到衍射极限的光模式。S. Wang等人，2007年；Grossman等人，2010年；Zhu等人，2012年；Pandarinath等人，2013年；Sakai等人，2013年；Shim等人，2016年；Zhang等人，2020年；Bhatia等人，2021年；Bayat等人，2022年；Ronzitti等人，2017年；Anselmi等人，2015年。为确保对特定目标区域进行选择性照明，必须在主激发光模式与到达样本的任何次要光线之间形成高对比度。文献中常见的问题包括全息系统中的零级光泄漏、焦点偏移的激发光以及光散射等现象（Ronzitti等人，2017年；Ronzitti等人，2018年）。在处理二维体外样本时，通常使用数字微镜装置来实现空间光调制，因为这是一种最简单且成本较低的装置，易于与显微镜系统结合使用（Ronzitti等人，2017年）。这类系统与包含光源和光学元件的控制板相结合——即数字光处理装置——能够生成横向空间分辨率高达1μm、时间分辨率低于1毫秒的光模式（Zaccaria等人，2026年；Pandarinath等人，2013年；Barral和Reyes，2017年；Anselmi等人，2015年）。这样的精确度对于在复杂的神经网络中选择性地刺激目标神经元尤为重要，有助于研究电路功能（Auslender等人，2025年），以及体外相干神经集合体的形成（Zaccaria等人，2026年）。

在相关文献中，基于DLP的照明系统通常是根据其强度、空间分辨率和对比度来描述的。然而，这类系统中一个重要但往往被忽视的问题是光泄漏，它会导致非目标区域的照明，从而降低空间分辨率，并对生物样本产生非预期的次要影响。确定此类非预期照明的阈值并制定相应的缓解策略，对于确保目标光刺激实验的可靠性和精确性至关重要。先前的研究已经发现，残留的背景照明会在表达ChR2的神经元中引发可测量的亚阈值反应（Barral和Reyes，2017年；Bhatia等人，2021年）。这种泄漏主要源自DLP本身的黑色水平值发光，它会在主要的空间光模式之下形成一种均匀的、微弱的背景。此外，样本平面上的散射光和反射光也会进一步增加有效刺激控制的难度。尽管这些成分的强度通常较低，但它们仍可能影响神经元的兴奋性，并干扰网络层面的实验。尽管基于DLP的系统已被广泛采用，但这类非预期照明对体外神经网络的影响至今仍缺乏充分的研究。

在本研究中，我们对集成在直立式共聚焦显微镜中的基于DLP的系统中的寄生光源进行了定量分析，并评估了实用的缓解策略。借助Zaccaria等人（2026年）开发的实验方法，我们利用钙成像技术以及针对活性依赖性标记物的免疫染色技术，研究了低强度照明对表达ChR2的神经元培养物的影响。我们假设，低于传统ChR2激活阈值的照明强度所引发的泄漏，不仅会通过钙成像技术检测到亚阈值调控，还可能影响网络层面的过程。通过这项研究，我们为确保Zaccaria等人（2026年）报告的生物学实验的可靠性提供了必要的技术分析和验证，并建立了一套用于表征寄生照明以及验证目标光遗传学实验照明条件的方法框架。

部分内容摘录
DLP和显微镜系统
我们将DLP E4500（德州仪器，型号：DLP? E4500TM评估模块）与一台直立式旋转盘共聚焦显微镜进行了光学对准（图2(a)）。该显微镜系统由奥林巴斯BX63直立显微镜、CrestOptics X-Light V2共聚焦旋转盘模块及其内置的VCS超分辨率模块、Lumencore Spectra X LED光源，以及一款Prime BSI背照式95%量子效率的高分辨率科学级CMOS相机（2048×2048像素）组成。DLP系统为……

结果
该光学系统由一台DLP E4500投影仪构成，该投影仪与直立式旋转盘共聚焦显微镜的EPI荧光端口进行了光学对准（图2(a)）。我们使用10倍干物镜（10x）和20倍水浸物镜（20xW）对系统的光泄漏及其对样本平面的影响进行了研究和分析。我们确定了两种主要的泄漏源（图2）：一种是从物镜中发出的固定背景光（DLP背景光），另一种则是光线与系统各部件相互作用产生的光。

讨论
基于DLP的系统被广泛用于体外神经元培养的光遗传学实验，其性能通常通过光强度、空间分辨率和对比度来衡量（Barral和Reyes，2017年；Pandarinath等人，2013年；Bhatia等人，2021年）。然而，在系统表征过程中，光泄漏问题常常被忽视。先前的研究指出，基于DLP的系统中存在的残留背景照明强度约为数十μW/mm2。Barral等人（2017年）也描述过类似的DLP系统……

结论
我们提出了一种可用于评估和缓解基于DLP的光遗传学系统中寄生照明的可重复性框架，该框架不仅涉及光学功率的测量，还着眼于生理影响的评估。我们发现，若不对其加以表征和控制，模式化照明系统中的寄生光可能会降低单细胞研究的特异性，干扰可塑性实验的结果，并引发非预期的神经网络激活。对我们系统的分析表明，10–50 μW/mm2的泄漏强度是可以被检测到的……

CRediT作者贡献声明
Clara Zaccaria：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，软件，方法论，研究，资金获取，正式分析，数据整理，概念构思。Asiye Malko?：写作——审阅与编辑，验证，方法论，研究，正式分析，数据整理，概念构思。Yasaman Heydari：写作——审阅与编辑，研究。Beatrice Vignoli：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证。

关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本研究报告的过程中，作者们使用了Google Gemini和OpenAI ChatGPT来提升文本的语言表达质量和可读性。在使用这些工具之后，作者们对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表的内容负全责。

未引用参考文献
Polyanskiy（2024年）

利益冲突声明
作者们声明不存在任何可能影响本研究客观性或本文撰写的财务利益、商业关联或其他潜在的利益冲突。

致谢
本项目获得了欧洲研究委员会在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助，项目编号为788793-BACKUP，资助对象为L.P.；此外还获得了意大利国家重要研究项目（PRIN）-2017年度招标项目的资助，项目编号为2017HPTFFCPRIN，资助对象为M.C.；还有特伦托和罗韦雷托储蓄银行CARITRO基金会的资助，项目编号为2022.0230，资助对象为C.Z.。我们还要感谢Antonino Cattaneo提供了-TreP-Arc3’-Nend-PSDTag-Venus-HA-Arc5’UTR和CAG-rtTA-IRES-TdTomato基因构建体。

Clara Zaccaria|Asiye Malko?|Yasaman Heydari|Beatrice Vignoli|Marco Canossa|Lorenzo Pavesi