《Journal of Structural Biology》：Biotin protein ligase C-terminal domain arginines are critical for ATP interaction & biotinyl-5’-AMP formation
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•生物素化是一个两步过程，包括a) 生成生物素-5’-AMP，以及b) 将生物素转移到蛋白质底物上。•删除利什曼原虫生物素蛋白连接酶的C端结构域会干扰这两个过程。•C端结构域中的三个精氨酸中有两个发生突变，会阻碍生物素化的第一步（生物素-5’-AMP的生成）。•这些精氨酸能与AT
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生物素化是一个两步过程，包括a) 生成生物素-5’-AMP，以及b) 将生物素转移到蛋白质底物上。
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删除利什曼原虫生物素蛋白连接酶的C端结构域会干扰这两个过程。
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C端结构域中的三个精氨酸中有两个发生突变，会阻碍生物素化的第一步（生物素-5’-AMP的生成）。
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这些精氨酸能与ATP的磷酸基团相互作用，从而促进生物素-5’-AMP的生成。
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C端结构域中的精氨酸具有类似精氨酸指的结构特征。
引言
生物素蛋白连接酶是一种参与翻译后修饰的酶，在所有生命形式中普遍存在。它能够催化生物素与底物中生物素羧基载体蛋白结构域的“AMKM”序列中保守的赖氨酸发生共价结合（Sternicki等人，2017年）。生物素化反应也是一个两步过程：首先，通过Mg2+-ATP和生物素的作用生成生物素-5’-AMP，实现生物素的活化；其次，目标蛋白质中保守的赖氨酸的ε氨基对生物素-5’-AMP发起亲核攻击，进而实现生物素的转移。大多数原核生物至少拥有一种对生存至关重要的依赖生物素的酶，比如脂肪酸合成途径中的第一个酶——乙酰辅酶A羧化酶（Tong，2013年）。而在真核生物中，有多种依赖生物素的酶，如甲基丙二酸辅酶A羧化酶、乙酰辅酶A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶以及丙酮酸羧化酶，它们都需要BPL来激活。这类羧化酶在多种代谢过程中起着关键作用，包括脂肪酸合成、糖异生以及氨基酸分解。
根据结构域组成，生物素蛋白连接酶可被分为三类。最简单的是I类酶，仅包含催化结构域和C端结构域。这类酶已在结核分枝杆菌、霍利科希火球菌以及风原艾克氏菌中被发现（Bagautdinov等人，2007年；Daniels和Beckett，2010年；Gupta等人，2010年；Purushothaman等人，2008年；Rajak等人，2021年）。II类连接酶的结构更为复杂，由三个结构域组成：N端的DNA结合结构域、约200个残基长的催化结构域，以及约50个残基长的C端结构域。这类酶存在于多种细菌中，比如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌（Bagautdinov等人，2005年；Gupta等人，2010年；Soares da Costa等人，2012年；Wilson等人，1992年）。III类生物素蛋白连接酶仅存在于真核生物中，其结构包括较大的N端结构域、中间的催化结构域以及C端结构域（Zempleni等人，2014年）。与II类酶不同，III类BPL的三个结构域都是完成生物素化反应所必需的（Beckett，2018年）。
I类和III类BPL属于单功能连接酶，而II类酶除了具备生物素转移功能外，还具有转录调控功能。生物素转移过程中的中间产物生物素-5’-AMP可作为该酶调控功能中的辅阻遏物（Dahm等人，1970年）。在生物素含量充足的条件下，当依赖生物素的羧化酶被饱和时，生物素-5’-AMP会大量积累并持续结合在BPL的活性位点上，进而促进酶的二聚化。形成的二聚体会与生物素操纵子结合，从而抑制生物素合成基因的转录。相反，当生物素供应不足时，二聚化过程会受到阻碍，无法实现抑制作用，生物素的合成就能持续进行。与这种调控功能相对应，拥有II类BPL的细菌同时也具备生物素生物合成机制。
尽管不同物种间的系统发育距离较远，序列相似度也很低，但从嗜热微生物到多细胞真核生物中的BPL在结构和功能上都表现出一致性。来自大肠杆菌和天蓝色链霉菌的II类生物素化酶的晶体结构显示，除了催化结构域和C端结构域外，还存在N端的螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域。在所有已研究的BPL中，催化结构域都由螺旋、链状结构以及五个位于表面的环状结构组成，这些结构共同构成了活性位点腔。其中，生物素结合环和腺苷酸结合环在保护反应中间体生物素-5’-AMP方面起着重要作用（Sternicki等人，2017年）。这五个环状结构，再加上催化结构域底部的β5和β6链，共同构成了生物素结合口袋（Bagautdinov等人，2005年；Rajak等人，2021年）。值得注意的是，在无配体状态下，嗜热微生物中的这些环状结构相对较为刚性，而中温微生物中的则较为灵活。不过一旦生物素与之结合，这些环状结构的灵活性就会下降（Bagautdinov等人，2008年；Kumar等人，2008年；Streaker和Beckett，1999年）。在三类BPL中，C端结构域都呈现出类似SH3结构域的折叠结构。
近年来，由于生物素化酶在原核生物生存中起着至关重要的作用，尤其是在抗菌药物耐药性日益严重的背景下，这类酶作为潜在的药物靶点受到了广泛关注（Feng等人，2016年）。在真核生物中，这类酶同样重要，因为多种羧化酶的激活都依赖于生物素化作用。人类全羧化酶合成酶出现单个基因突变就会导致多种羧化酶缺乏症，这一现象凸显出深入研究这类酶家族的结构和功能的必要性（Gaschignard等人，2024年；Narang等人，2004年）。到目前为止，大多数研究都集中在BPL的N端或催化结构域上，而C端结构域的功能作用则几乎尚未被探索。此前有一项针对大肠杆菌BPL（BirA）的研究发现，C端尾部的“SLR”结构 motif中的某个精氨酸是调控ATP结合与水解的关键因子。由于大多数I类BPL都存在这一结构 motif，说明它可能具有共同的调控功能。有趣的是，利什曼原虫的生物素化酶中并不存在这种SLR motif，这提示C端结构域可能存在其他调控机制。
在本研究中，我们以I类生物素蛋白连接酶——利什曼原虫生物素蛋白连接酶为研究对象，发现该酶C端结构域中的两个精氨酸可以替代其他I类BPL中的SLR motif功能。值得注意的是，这两个精氨酸会延伸到活性位点内，与ATP的γ磷酸基团发生特异性相互作用，对生物素-5’-AMP的生成起着关键作用。如果这两个精氨酸中的任何一个发生突变，都会降低酶的生物素化活性。综上所述，这些研究结果证明了C端结构域在生物素化反应中的重要性，这一特性在所有BPL中都存在，即便它们的序列和保守结构 motif存在差异。利什曼原虫的这种酶非常适合用于本研究，因为它具有较高的溶解度，其C端结构域缺失突变体稳定性良好，还存在多种与配体结合状态的晶体结构，同时作为I类真核酶，它在进化上也具有重要意义。
章节要点
克隆、表达与纯化
我们团队之前已经利用从Bei Resources获得的利什曼原虫基因组，克隆出了利什曼原虫生物素蛋白连接酶以及它的底物——甲基丙二酸辅酶A羧化酶还原酶的生物素羧基载体蛋白结构域（Rajak等人，2021年）。我们还在pET28a (+)载体上构建了利什曼原虫生物素蛋白连接酶的C端结构域缺失突变体（ΔC），该突变体是通过删除Asp 216至Phe 263这段序列得到的（UniProtKB编号为Q4Q6F6），并通过Sanger测序确认了这一缺失。
质粒
利什曼原虫生物素蛋白连接酶在晶体中以二聚体形式存在，但在溶液中主要以单体形式存在
利什曼原虫生物素蛋白连接酶属于I类酶，由催化结构域和C端结构域组成。虽然它的催化结构域与其他I类BPL在结构上具有同源性，但其C端结构域在1.97 ?分辨率的晶体结构中（PDB编号为6JHU）却呈现出独特的结构特征：它仅由三条β折叠链组成（β9↓、β10↑、β11↓），而原本在其他BPL中由Asp 216到Leu 234这段序列构成的β7–β8折叠链在这里则变成了环状或无规卷曲结构。此外，该结构中的主链羰基也...
讨论
目前对于生物素蛋白连接酶的结构、功能及调控机制的了解，大多来自对风原艾克氏菌、霍利科希火球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌等微生物的I类酶，以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌等微生物的II类酶（如BirA）的研究（Ayanlade等人，2025年；Bagautdinov等人，2008年；Ingaramo和Beckett，2011年；Jeong等人，2024年；Soares da Costa等人，2012年；Tron等人）。
UniProtKB编号
UniProtKB Q4Q6F6
UniProtKB O57883
UniProtKB P06709
UniProtKB P96884
CRediT作者贡献说明
Sonika Bhatnagar： 方法学、实验研究、定量分析。Debodyuti Sadhukhan： 方法学、实验研究、定量分析。Manoj Kumar Rajak： 实验研究。Monica Sundd： 文章撰写——初稿编写、资源获取、项目管理、概念设计。
利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢印度政府生物技术部的资金支持与基础设施保障。本研究中所使用的某些试剂是由BEI Resources、NIAID、NIH提供的，具体为来自利什曼原虫NIH SD品系的基因组DNA（编号为MHOM/SN/74/SD，编号NR-48764）。
Sonika Bhatnagar|Debodyuti Sadhukhan|Manoj Kumar Rajak|Monica Sundd
