《Molecular & Cellular Proteomics》：Integrated Multi-omics Analysis Uncovers Molecular Dysregulation in Glycosylceramide Synthase-Deficient Human Induced Pluripotent Stem Cells
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摘要：糖基鞘脂（GSLs）是膜脂，具有高度多样化的糖基化模式。它们参与多种细胞过程，并可能与疾病相关。为了研究它们在体外早期哺乳动物发育过程中的作用，研究人员通过CRISPR/Cas9在人诱导多能干细胞（hiPSCs）中敲除了编码葡萄糖神经酰胺合酶（UGCG）
摘要：糖基鞘脂（GSLs）是膜脂，具有高度多样化的糖基化模式。它们参与多种细胞过程，并可能与疾病相关。为了研究它们在体外早期哺乳动物发育过程中的作用，研究人员通过CRISPR/Cas9在人诱导多能干细胞（hiPSCs）中敲除了编码葡萄糖神经酰胺合酶（UGCG）的UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶基因（UGCG）。通过糖基组学分析确认了UGCG的功能损伤。与野生型（WT）hiPSCs相比，UGCG敲除（KO）hiPSCs表现出正常的形态、生长行为和干细胞标志物表达。此外，KO细胞保持了多能性，证据是其能够体外分化为三个胚层，并在体内形成畸胎瘤。对来自WT和UGCG KO hiPSCs的移植畸胎瘤进行定量蛋白质组学分析，揭示了众多蛋白质的差异表达，其中信号转导或蛋白质定位与运输相关通路显著富集。关键激酶及其靶标的磷酸化谱分析发现UGCG KO hiPSCs中STAT家族转录因子的激活减少。互补的转录组学分析结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）对WT和UGCG KO hiPSCs及其外胚层衍生物中的差异表达基因进行分析，预测UGCG KO hiPSCs中与信号通路相关的蛋白质呈正富集。全局脂质组学分析显示，UGCG KO hiPSCs及其外胚层分化衍生物中的鞘磷脂水平显著升高，而总神经酰胺含量在UGCG KO和WT细胞之间保持相当。总之，尽管没有明显的表型变化，研究人员的发现表明糖基鞘脂缺乏会在hiPSCs中诱导多种分子扰动。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
糖基鞘脂（GSLs）是哺乳动物细胞膜中的两亲性分子，由神经酰胺脂质部分和聚糖头部组成，参与细胞间相互作用、信号转导和细胞内运输等过程。GSLs代谢失调可导致多种疾病，如Fabry病、Gaucher病等。在小鼠模型中，UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶基因（UGCG）编码的葡萄糖神经酰胺合酶（UGCG）缺失导致胚胎在E7.5天致死，表明GSLs在早期发育中至关重要。然而，其在人类早期发育中的具体分子功能尚不明确。为此，研究人员建立了UGCG缺陷的人诱导多能干细胞（hiPSCs）模型，通过多组学分析探讨GSLs的调控作用。
**研究内容与结论**
研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除hiPSC系Phoenix中的UGCG基因，并通过糖基组学、蛋白质组学、磷酸化组学、转录组学和脂质组学进行系统分析。结果表明，UGCG敲除（KO）并不影响hiPSCs的多能性标志物表达、体外分化为三胚层能力以及体内畸胎瘤形成。然而，多组学分析揭示了广泛的分子变化：蛋白质组学显示信号转导和蛋白质定位相关通路富集；磷酸化分析发现STAT家族转录因子激活减弱；转录组学结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）预测信号通路相关蛋白正富集；脂质组学显示鞘磷脂（SM）水平显著升高，而神经酰胺含量不变。这些发现表明，GlcCer基GSLs缺失虽不破坏多能性，但诱导了多种分子扰动，提示GSLs在早期发育中起适应性调节作用，而非必需决定因素。该论文发表在《Molecular》。
**主要技术方法（不超过250字）**
本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除hiPSC（来源为Phoenix细胞系）中的UGCG基因。关键分析方法包括：多重毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测（xCGE-LIF）进行GSL衍生聚糖谱分析；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对畸胎瘤（来自NSG小鼠）进行定量蛋白质组学；人磷酸激酶抗体芯片检测磷酸化状态；RNA测序进行转录组学分析，并使用IPA通路富集；纳米电喷雾电离串联质谱（nanoESI-MS/MS）进行全局脂质组学分析。
**研究结果**
**1. UGCG基因缺失不影响hiPSCs的多能性标志**
通过CRISPR/Cas9构建两个独立UGCG KO克隆（KO1和KO2），Sanger测序确认移码突变。与野生型（WT）相比，KO细胞保持正常形态、增殖速率，且多能性标志物（NANOG、OCT4、LIN28、SOX-2）mRNA表达水平一致。体外分化为内胚层、中胚层和外胚层后，流式细胞术检测谱系特异性标志物（如CXCR4、Nestin、NCAM/EpCAM）显示分化效率无显著差异。畸胎瘤实验（注射至免疫缺陷小鼠）进一步证实KO细胞能形成三胚层结构，证明多能性保持。
**2. UGCG基因操作完全消除GlcCer基GSLs的合成**
xCGE-LIF糖基组学分析显示，WT hiPSCs表达典型GSL衍生聚糖（如SSEA-3、SSEA-4、Lc4、SSEA5），而两个UGCG KO克隆中均未检测到这些信号，表明GlcCer基GSLs完全缺失。同时，N-聚糖谱未受显著影响，确认UGCG缺失的特异性。
**3. GSL缺乏扰乱激酶信号通路**
使用磷酸激酶抗体芯片检测hiPSCs和d7外胚层衍生物中的磷酸化状态。在UGCG KO hiPSCs中，STAT1、STAT3、STAT5a/b、PDGF Rβ、p53和p38α的磷酸化水平显著降低。在外胚层细胞中，Fgr磷酸化略升高，而MSK1/2磷酸化降低，提示GSLs调控干细胞维持和分化相关信号。
**4. UGCG缺乏导致广泛的基因表达变化**
RNA测序分析鉴定出346个（hiPSC阶段）和465个（d7外胚层）差异表达基因。在两种时间点均受影响的基因中，CLEC2A表达下调，锌指蛋白基因（ZNF248、ZNF562上调，ZNF560下调）明显。IPA通路分析显示，在hiPSC阶段富集“Rho GTPase循环”、“蛋白质分选信号通路”、“细胞外基质组织”和“IL-27信号”；在d7细胞中富集“Rho GTPase循环”、“IL-1家族信号”和“SREBF激活基因表达”。
**5. 脂质组学揭示UGCG缺陷hiPSCs中鞘磷脂水平升高**
全局脂质组学分析定量了24种脂质类别。在WT和UGCG KO细胞中，酰基磷脂酰胆碱（aPC）为主要脂质，但总水平无显著差异。值得注意的是，与WT相比，UGCG KO hiPSCs和d7外胚层衍生物中鞘磷脂（SM）相对水平显著升高，而神经酰胺（Cer）含量相当。亚类分析显示，SM中短链脂肪酸（34:1,2或36:1,2）在WT中增加，长链脂肪酸（40:1,2或42:1,2）在KO中富集。流式细胞术检测GalCer和硫酸酯水平无基因型差异，进一步确认GlcCer基GSLs缺失。
**6. UGCG缺失与hiPSC衍生畸胎瘤的蛋白质组学改变相关**
对WT和UGCG KO1 hiPSC衍生畸胎瘤进行LC-MS/MS蛋白质组学分析，鉴定出3152种蛋白质，其中205个上调、98个下调。主成分分析（PCA）显示两组样本明显分离。通路富集分析表明，差异蛋白主要参与“细胞器定位建立”、“内体运输”、“蛋白质靶向膜”、“细胞内蛋白质运输”等细胞内运输过程，以及“细胞信号”、“细胞通讯”等信号通路。此外，脂质生物合成相关蛋白（如ACLY上调、ACOT1下调）和STAT2蛋白水平降低，与脂质代谢和信号通路变化一致。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，GSLs在哺乳动物中功能多样，既往小鼠模型显示UGCG缺失导致胚胎致死，但在hiPSCs中，UGCG KO并不影响多能性，这与小鼠胚胎干细胞研究一致。多组学分析揭示，GSL缺乏导致鞘磷脂水平升高，神经酰胺向SM途径重定向；STAT信号通路磷酸化减弱；细胞内运输和信号通路相关基因表达改变。这些分子变化表明，GlcCer基GSLs在早期发育中主要参与细胞适应和稳健性调节，而非必需功能。研究结论翻译如下：据研究人员所知，本研究首次建立人类UGCG KO iPSC模型，并应用多组学方法探讨GSLs在体外早期发育过程中的功能作用。研究显示，GlcCer基GSLs缺失不损害核心多能性或定向分化能力，而是在多个细胞系统中诱导不同的分子改变。这些结果揭示，GlcCer基GSLs在早期发育过程中促进细胞适应和稳健性，而非作为不可或缺的决定因素。总之，本研究为糖基鞘脂在人类干细胞模型中的调节作用提供了新见解。
