通过GLUT1/HK2 mRNA递送介导成熟牙髓干细胞代谢重编程增强牙髓再生

《International Journal of Oral Science》：Enhancing pulp regeneration through metabolic reprogramming of mature dental pulp stem cells mediated by GLUT1/HK2 mRNA delivery

　　

年龄相关的成熟牙髓干细胞(DPSC)促血管生成能力下降严重限制了牙髓再生。研究人员确定由葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和己糖激酶2(HK2)表达降低驱动的糖酵解代谢受损是关键机制，因其抑制削弱了内皮管形成。为逆转此现象，研究人员开发了氨解的高度支化聚(β-氨基酯)(HBPA)作为GLUT1/HK2 mRNA共递送载体，实现了>90%的转染效率和优异的生物相容性。体外实验中，重编程成熟DPSC的条件培养基使毛细血管长度增加2.0倍，分支点增加2.3倍，将血管生成潜能恢复至与未成熟DPSC相当的水平。该功效在体内稳健转化，牙根切片模型显示重编程细胞生成的组织血管密度为10.2 vessels per mm2，是对照组的2.5倍。关键的是，该血管化程度与基准未成熟DPSC达成的水平在统计上无差异。研究人员的研究表明，HBPA介导的代谢重编程通过恢复“代谢-ECM-血管生成轴”有效逆转成熟DPSC活力，为可预测的血管化牙髓再生提供了一种可转化的策略。

研究背景方面，牙髓是位于牙内的高度血管化软组织，在营养运输、感觉感知和损伤反应中起着至关重要的作用。龋病、创伤或感染导致的病理是最常见的口腔疾病。尽管传统的根管治疗能有效消除感染，但不可避免地牺牲了牙齿活力，常导致长期并发症如脆性增加和根折。因此，牙髓再生已成为牙髓治疗中的一种变革性方法，代表了从传统根管清创向基于生物学的组织再生的重大进步。再生性牙髓治疗的目的是实现牙髓-牙本质复合体的功能性再生，而非仅用惰性材料替代。然而，牙髓再生面临若干重大挑战：狭窄的根尖孔限制血液供应和干细胞归巢；复杂的根管解剖结构使感染控制复杂化；来源于成熟牙齿的DPSC表现出显著的功能下降，包括增殖能力降低、多谱系分化潜能受损以及促血管生成潜力低于年轻供体者。此外，细胞-支架构建体移植到受限的根管空间由于缺乏即时血管吻合，必然造成严重的缺血缺氧微环境，导致功能性血管网络建立前显著的细胞凋亡和低存活率。因此，增强种子细胞对这种“缺氧冲击”的代谢适应性是成功组织植入的前提。目前成熟恒牙的牙髓再生治疗效果欠佳，迫切需要新策略来逆转成熟DPSC的功能退化。DPSC因其可及性、丰富性、低免疫原性和多向分化能力被认为是牙髓再生的理想种子细胞，但其再生能力受供体年龄影响显著，成熟DPSC表现出复制性衰老和功能下降。未成熟DPSC通过增强糖酵解维持能量稳态，而成熟DPSC显示线粒体功能障碍和糖酵解通量低效。现有的缺氧预处理或细胞因子动员等方法未能解决代谢功能障碍的核心问题。近期分析揭示未成熟DPSC表现出高水平的糖酵解活性，主要由GLUT1和HK2驱动，这两个关键酶控制糖酵解通量。mRNA疗法可通过瞬时精确表达靶基因调节细胞代谢，但依赖于安全高效的递送载体。基于此，研究人员假设通过GLUT1和HK2 mRNA介导增强糖酵解通量可恢复成熟DPSC功能，并开发了HBPA用于共递送以测试该假说。

关键技术方法方面，研究人员使用来自9–10岁儿童（Nolla分期8–9，未成熟组）和18岁青年（Nolla分期10，成熟组）的人类前磨牙样本分离DPSC。采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析成熟与未成熟牙髓转录组景观。合成氨解高度支化聚(β-氨基酯)(HBPA)作为mRNA递送载体并通过凝胶渗透色谱(GPC)和¹H NMR表征。优化HBPA/mRNA复合物重量比(w/w)和mRNA剂量以评估转染效率和细胞活性，利用流式细胞术定量。通过细胞外酸化率(ECAR)和氧消耗率(OCR)检测细胞糖酵解与线粒体氧化磷酸化功能。采用免疫荧光、Western blot和RT-qPCR检测GLUT1、HK2及细胞外基质(ECM)蛋白表达。建立DPSC与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养系统及无支架3D培养评估血管生成与ECM沉积。利用皮下牙根切片移植模型在免疫缺陷小鼠中进行体内再生验证，进行H&E、Masson及免疫荧光染色分析组织结构与血管密度。

研究结果部分，各小节结论如下：

Glycolysis of DPSCs drives dental pulp vascular development：研究人员通过scRNA-seq发现未成熟DPSC高表达基因显著富集于厌氧呼吸和ATP代谢通路。ECAR检测显示未成熟DPSC基础糖酵解率是对照的2.2倍，糖酵解能力和储备分别增强1.8倍和1.5倍。体内给予糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)导致CD31表达显著降低，FN1和COL1A2沉积分别减少31.2%和26.8%，证实活跃糖酵解对DPSC促血管生成至关重要。

Glycolytic metabolism is functionally indispensable for the pro-angiogenic activity of immature DPSCs：缺氧共培养体系中，2-DG阻断未成熟DPSC糖酵解使HUVEC进入S/G2/M期比例从45.3%降至21.8%。管形成实验显示抑制糖酵解使分支点减少38.8%、毛细血管总长度减少40.9%。无支架3D培养中2-DG使FN1和COL1A2表达分别降低40.1%和34.1%，表明糖酵解紧密耦合于未成熟DPSC的促血管生成多功能过程。

Upregulation of GLUT1 and HK2 is the molecular basis for enhanced glycolysis in immature DPSCs：免疫荧光显示未成熟牙髓组织GLUT1和HK2蛋白分别上调1.3倍和1.5倍，分离的未成熟DPSC中分别上调1.6倍和1.6倍，而下游磷酸果糖激酶(PFKM)和丙酮酸激酶M2(PKM2)无显著差异，证明GLUT1和HK2是增强糖酵解通量的特异性分子基础。

Synthesis and characterization of HBPA：研究人员通过“A2+B3+C2”型Michael加成结合“自上而下”氨解策略合成HBPA。反应12小时重均分子量(M_w)达10 400 g/mol，分散度(D)2.45；20小时后达约14 900 g/mol；氨解纯化后M_w为11 300 g/mol，D为2.22。¹H NMR确认化学结构与纯度，实现可控合成。

HBPA mediates high mRNA transfection efficiency in DPSCs：在w/w 60:1和mRNA剂量100 ng条件下，HBPA转染效率达90.02%，是商用试剂LipoMax（32.17%）的2.31倍。即使在最高w/w 80:1和100 ng剂量下细胞活力仍高于95%，证明HBPA在DPSC中具有高效安全的mRNA转染能力。

Physicochemical properties of HBPA and HBPA/mRNA polyplexes：HBPA在w/w 20:1时mRNA结合亲和力为96.3%，更高比例接近100%。复合物粒径在66.3 nm至110 nm之间，具轻微正Zeta电位，透射电镜(TEM)显示为均匀致密球形形态，利于细胞摄取和血清稳定性。

Utility of HBPA-mediated GLUT1 and HK2 mRNA delivery in mature DPSCs：HBPA递送GLUT1 mRNA使转录水平增加6.1倍（蛋白荧光强度增2.0倍，Western blot增2.3倍），HK2 mRNA转录增4.7倍（蛋白增4.1倍，Western blot增4.3倍）。蛋白表达第1天上调，第3天维持，第7天下降。CCK-8显示转染后增殖显著增强，证实瞬时代谢重编程重启合成代谢。

Glycolytic metabolic reprogramming via co-delivery of GLUT1 and HK2 mRNA fully restores the pro-angiogenic capacity of mature DPSCs：共转染使成熟DPSC基础糖酵解增加3.1倍，糖酵解能力增强3.2倍，优于单转染。克隆形成效率增加2.3倍至未成熟水平。无支架3D培养中FN1和COL1A2分别提升2.9倍和3.7倍。条件培养基使HUVEC毛细血管长度和分支点均增加2.1倍，恢复至未成熟DPSC水平，重建“代谢-ECM-血管生成轴”。

In vivo validation of glycolytic metabolic reprogramming via co-delivery of GLUT1 and HK2 mRNA for dental pulp regeneration：体内移植4周后，重编程DPSC生成丰富有序的类牙髓组织。FN1、LAMA4、COL1A2阳性面积分别增加4.0倍、2.8倍和4.0倍，与未成熟组无差异。CD31⁺血管密度达10.2 vessels per mm²，是对照（4.0）的2.5倍且无炎症因子IL-1β和TNF-α升高，证实生理性血管化再生。

讨论部分总结中，研究人员指出成熟DPSC功能衰退源于GLUT1/HK2瓶颈导致的糖酵解受损，而非全局酶下调。HBPA凭借高度支化结构和近中性电位实现>90%转染且无毒，其瞬时表达特性避免插入突变，在时间窗内提供代谢适应。该研究整合机制发现与纳米技术创新，明确糖酵解是未成熟DPSC血管化的机制基石，GLUT1/HK2共表达是靶点，HBPA是优选平台，恢复了血管化牙髓-牙本质复合体再生，为解决年龄相关DPSC功能障碍提供了可转化策略。

研究结论翻译：牙髓再生是牙科重要研究领域，DPSC固有再生能力使其成为关键治疗剂，但成熟DPSC促血管生成能力低下限制临床转化。研究人员发现未成熟DPSC高表达GLUT1和HK2构成天然“代谢屏蔽”，糖酵解产物乳酸调控组蛋白乳酸化及ECM合成，确立“代谢-ECM-血管生成轴”。靶向GLUT1/HK2的mRNA共递送产生协同“推-拉”效应最大化功能输出，且未引起炎症因子升高，属生理再生血管化。HBPA合成策略平衡高负载、内体逃逸和生物相容性，其“命中即走”特性完美匹配再生时间窗。该研究通过从scRNA-seq到体内移植的分步验证，证明糖酵解是机制基石、GLUT1/HK2是分子靶点、HBPA是递送平台、功能恢复得以实现，从根本解决成熟DPSC功能障碍，为临床牙髓再生提供可扩展且供体非依赖的解决方案。论文发表在《International Journal of Oral Science》。

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