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工程化或实验室进化的蛋白质通常具有次优的稳定性、活性或特异性。研究人员应用了基于人工智能（AI）的蛋白质序列设计来应对实验酶进化中的挑战。使用ProteinMPNN模型，研究人员重新设计了三种不同的肉毒杆菌神经毒素（BoNT）蛋白酶，生成了具有改进稳定性和完全
工程化或实验室进化的蛋白质通常具有次优的稳定性、活性或特异性。研究人员应用了基于人工智能（AI）的蛋白质序列设计来应对实验酶进化中的挑战。使用ProteinMPNN模型，研究人员重新设计了三种不同的肉毒杆菌神经毒素（BoNT）蛋白酶，生成了具有改进稳定性和完全催化效率的变体。研究人员假设重新设计的酶可能比其野生型（WT）对应物更具突变稳健性，因此可能成为进化新功能的更好起点。研究人员进行了并行的噬菌体辅助连续进化（PACE）实验，分别以AI重设计的蛋白酶或相应的WT蛋白酶为起点。以三种不同的重设计酶为起点进行进化，始终比在同一选择中进化WT蛋白酶产生更高活性的蛋白酶。在四次进化活动中，重设计赋予了稳健性，使得能够获得原本无法获得的高功能序列，这通过重设计进化突变在WT酶背景中无法发挥功能得到证实。当重设计提高了起点附近序列空间的适应性时，重设计起点以更快的速度适应。最后，研究人员进化了WT和AI重设计的BoNT/E蛋白酶，使其选择性切割治疗相关蛋白ataxin-2。从重设计起点进化的蛋白酶达到了更高的催化效率和稳定性，同时最小化了天然底物切割，与从WT BoNT/E进化出的最佳变体相比，对ataxin-2的选择性提高了79倍以上。这项研究建立了一个实用的工作流程，使用AI重设计的起点来进化酶，与从天然蛋白质进化的酶相比具有改进的特性，对蛋白质科学具有广泛影响。
**研究背景与问题**
天然酶在实验室进化中常作为起点，但其稳定性有限，多数突变会降低折叠能力，导致进化后的酶在活性、特异性或稳定性上表现欠佳。传统方法虽能改变底物特异性，但进化后的催化效率通常低于天然酶，且可能保留不必要的天然底物活性。研究人员尝试通过先提高热稳定性再进化功能，但需额外时间和劳动，且难以同时维持功能。计算蛋白质设计（如ProteinMPNN）可提高稳定性，但设计新功能仍具挑战。本研究旨在整合计算重设计与实验室进化，以克服各自局限，利用重设计酶作为更优起点，提升进化效率和结果。
**研究内容与结论**
研究人员使用ProteinMPNN对肉毒杆菌神经毒素（BoNT）蛋白酶（包括BoNT/E、BoNT/F和BoNT/X）进行序列重设计，获得稳定性提高、催化效率保持或提升的变体。随后，将重设计后的BoNT/E蛋白酶（D3）与野生型（WT）蛋白酶并行进行噬菌体辅助连续进化（PACE），针对三个不同难度的底物以及治疗相关蛋白ataxin-2进行进化。结果表明，以重设计酶为起点的进化始终产生更高活性的蛋白酶，且能访问WT酶无法利用的突变空间，进化速率更快，成功率更高。在ataxin-2进化中，重设计起点进化出的蛋白酶实现了79倍以上的特异性提升，且几乎检测不到天然底物切割。该研究发表于《Nature》，建立了整合计算重设计与实验室进化以高效生成具有改进特性酶的工作流程。
**关键技术方法**
研究人员使用ProteinMPNN模型对BoNT蛋白酶进行序列重设计，通过AlphaFold2（AF2）预测结构并评估模型置信度（pLDDT）和与WT结构的相似性（RMSD）。采用噬菌体辅助连续进化（PACE）和自动化eVOLVER及min-eVOLVER装置进行平行进化实验。此外，还使用PROSS方法进行对比重设计，并通过LoopSeq高通量长读长测序深度分析基因型分布。所有进化实验均在大肠杆菌宿主中进行，无样本队列来源。
**研究结果**
**蛋白酶重设计提高稳定性**：通过ProteinMPNN对BoNT/E、BoNT/F和BoNT/X进行重设计，生成变体D1–D3等，其热稳定性（T
m）提高，可溶性表达增加，催化效率（k
cat/K
m）为WT的1.7–2.8倍，且在PACE选择回路中活性更高。PROSS重设计也获得类似结果，但ProteinMPNN重设计变体的平均T
m更高（55.2°C vs 52.3°C）。
**重设计增强已进化蛋白酶**：将PACE进化出的PTEN切割突变（E(4130)A2）移植到重设计背景（D1–D3）中，表达量提高2.2–5.2倍，热稳定性改善，PTEN切割活性保持或提升，且未检测到天然底物SNAP25切割，在HEK293T细胞中产物形成量提高4.5倍和3.9倍。
**重设计改善进化结果**：在三个难度递增的底物（415、413、412）上并行进化，重设计起点（D3）始终产生更高活性的蛋白酶，如底物415上D3进化变体回路激活7.7倍 vs WT的2.6倍。重设计起点能利用WT酶无法兼容的突变（如K225E），且进化速率更快，如底物413上D3单突变即达高活性，而WT需多突变。在最难底物412上，WT有2/4重复失败，D3全部成功。
**基因型频率的进展**：LoopSeq测序显示，D3进化群体中出现了WT群体中罕见的独特基因型，且这些基因型在WT背景中无功能。重设计起点支持局部基因型生存，而WT起点需更远距离的基因型。
**重设计扩展适应度景观**：包括D4（高稳定性但低活性）和PROSS1在内的不同重设计起点均优于WT，且在进化中产生独特的高活性基因型。重设计提升了局部序列空间的适应度，使单点突变即具功能，而WT周围序列活性低。
**进化特异性ataxin-2蛋白酶**：针对疾病相关蛋白ataxin-2进行进化，重设计起点（D3）进化出的蛋白酶切割ataxin-2速率比WT进化蛋白酶快1.7倍，且未检测到SNAP25切割，特异性提高79倍以上。在HEK293T细胞中，重设计进化蛋白酶表达更高，产物生成更高效，且毒性更低。移植实验表明，重设计进化突变在WT背景中无功能，而WT进化突变在重设计背景中功能良好。
**讨论与结论**
研究整合了计算蛋白重设计与实验室进化，克服了各自局限，生成了稳定且具有高效新功能的蛋白酶。重设计起点提高了局部序列空间的适应度，加速了进化，使酶能访问WT酶无法达到的高功能突变空间。针对ataxin-2的重设计进化蛋白酶实现了几乎完全的特异性重编程，而WT进化未能达到。这一工作流程可推广至其他能通过序列重设计稳定化且能在PACE中筛选功能的蛋白质，为生成比天然酶更优的酶提供了实用方法。研究结论：当前计算蛋白设计和实验室进化可共同克服稳定性与功能进化的权衡，产生稳定且具有高效新功能的蛋白酶；重设计起点在进化中表现出更高的活性、特异性和稳定性，建议将稳定化重设计起点作为实验室进化的起点。
