果蝇中出生顺序与神经元身份的全球分子代码

《Nature》：A global molecular code for birth order and neuronal identity in Drosophila

　　

功能性神经回路的组装依赖于具有精确分子身份和连接性的多样化神经类型的生成。要揭示神经系统内神经元特化和布线的普遍原理，需要对其多样性进行系统且高分辨率的表征，而单细胞转录组学（single-cell transcriptomics, scRNA-seq）和连接组学（connectomics）的进展最近使这成为可能。然而，将神经元的分子身份与回路结构联系起来仍然是一个关键挑战。研究人员在此呈现了黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）神经索（nerve cord）的高分辨率发育转录图谱，该神经索是感觉-运动回路的中枢枢纽。该图谱相对于其参考连接组具有显著的38倍聚合覆盖度，捕获了广泛的分子多样性，并实现了与成虫连接组的稳健对齐。研究人员确定了神经索内神经元多样性的三个发育原理。第一，神经发生的时间塑造了分子身份的多样化：胚胎期出生的神经元比幼虫期出生的神经元分化更快，这在成虫连接组中也被观察到。第二，来自所有谱系的神经元共有的17个转录因子（transcription factors, TFs）为出生顺序提供了全球分子身份代码。最后，通过将性别特异性转录谱映射到连接组，研究人员确定了雌性特异性凋亡和转录分歧是性别规范的关键全球驱动因素。通过揭示分子身份的关键组织轴，该图谱为剖析支撑神经回路发育和进化的分子机制开辟了途径。

**论文解读：果蝇神经索出生顺序与神经元身份的全球分子代码**

**研究背景与问题**
大脑处理信息并产生适应性行为的能力依赖于其细胞组成和回路组织。在发育过程中，神经元获得特定分子身份，这些身份定义其生理功能并引导其整合到精确的回路结构中。尽管空间和时间模式化机制协调神经元命运的研究已开始阐明，但尚无法解释大脑的庞大细胞复杂性。为了全面理解神经元如何在整个神经系统中被特化，需要对这种多样性进行系统、高分辨率的表征。过去十年，这一需求推动了两类大规模图谱构建工作：利用单细胞转录组学（scRNA-seq）定义分子身份，以及利用连接组学揭示神经元的解剖和突触关系。然而，将转录组学类型与解剖学类型在脊椎动物中建立全面对应关系目前尚无明确路径，但对于高度定型且细胞数量较少的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑，情况更为乐观。尽管如此，解剖和分子细胞类型的全面交叉鉴定仍具挑战性。现有研究显示，转录组覆盖度是限制因素：在视叶之外，大多数细胞类型每半球仅约2个神经元，而单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集需要至少20-30个细胞才能识别一个细胞类型。因此，低覆盖度图谱本质上不适合解析完整的连接组多样性。此外，高覆盖度本身可能不足以解析连接组类型，因为发育图谱更适合捕获连接组中的多样性。基于这些考虑，研究人员构建了果蝇腹神经索（VNC）的发育转录图谱，该神经索容纳形成神经系统与身体核心接口的感觉-运动回路。

**研究内容与结论**
研究人员通过scRNA-seq构建了VNC的发育转录图谱，覆盖4个发育阶段（蛹形成后6、24、36和48小时，h.a.p.f.），包含459,091个细胞，实现了38倍聚合覆盖度，并实现了与成虫连接组的稳健对齐。该图谱揭示了神经元多样性的三个发育原理：（1）神经发生时间塑造分子身份多样化：胚胎期出生的初级神经元比幼虫期出生的次级神经元分化更快；（2）17个共享转录因子（shTFs）在所有谱系中定义了出生顺序的全球分子身份代码；（3）通过将性别特异性转录谱映射到连接组，发现雌性特异性凋亡和转录分歧是性别规范的关键驱动因素。该研究发表在《Nature》上，提供了研究神经回路发育和进化分子机制的平台。

**关键技术方法**
研究人员使用scRNA-seq生成图谱，样本来自92只个体动物，覆盖4个发育阶段（6、24、36和48 h.a.p.f.）和两种性别，每个阶段-性别条件由5-18个生物学重复代表，涵盖5-11种不同基因型。采用基于单核苷酸多态性（SNP）的样本解复用技术区分技术变异与生物学变异。通过荧光激活细胞分选和10x Genomics平台制备文库，并在NovaSeq6000上测序。数据分析使用Seurat进行整合和聚类，通过devCellPy机器学习框架注释神经发生波、半谱系和体节，利用Monocle3进行轨迹推断，并使用G2G进行轨迹对齐。连接组分析使用MANC和FANC数据集，通过NBLAST和余弦相似性进行跨性别匹配。

**研究结果**
**1. 神经索发育图谱**
通过回归成熟相关变异，整合了不同阶段的转录组，获得了302,765个神经元，代表雄性VNC连接组（MANC）每侧7,880个神经元，覆盖度38倍。UMAP嵌入显示神经元按发育阶段分层，nSyb表达随成熟度递增。

**2. 两种神经元多样化模式**
根据Imp和dati的互斥表达识别初级和次级神经元。初级神经元在UMAP中形成点状小簇，次级神经元形成延伸的低维流形轨迹。初级神经元簇大小中位数为1个细胞（与连接组中每类型神经元中位数一致），次级神经元中位数为13个细胞。次级神经元簇间混合更显著，形成有序轨迹结构，表明其分化更渐进。连接组分析验证了初级神经元与最相似邻居的差异大于次级神经元。

**3. 半谱系连接图谱与连接组**
通过神经递质注释、GFP报告系标记和文献标志物，对超过95%的次级神经元和44%的初级神经元进行了半谱系注释。图谱中半谱系大小与连接组高度相关（R2=0.9）。通过Hox基因表达注释体节，实现了94%的次级神经元和43%的初级神经元的体节预测。半谱系-体节联合注释将图谱分为122个次级神经元组，每组平均映射到连接组中51个神经元或26个类型，相关性R2=0.71。轨迹复杂度与连接组中节间同源性显著相关（P=2×10??）。

**4. 出生顺序的全球时间代码**
沿轨迹假时间分析发现1,508个差异表达基因，其中149个为转录因子，40个共享于超过50%的半谱系。通过轨迹对齐，识别出17个共享转录因子（shTFs），按保守顺序表达，产生33个保守表达峰。这些shTFs在发育阶段持续表达，并在成虫VNC和中枢脑中验证了9个的蛋白表达。通过split-GAL4系统，利用shTF与半谱系标志物的交集标记了特定神经元群体，验证了遗传可及性。EdU脉冲追踪实验确认shTF表达与神经元出生时间锁定。在14A半谱系中异位表达Br消除了bab1表达并改变投射形态，证明shTF作为末端选择基因的作用。该shTF代码在脑的gnathal ganglia和superior lateral protocerebrum中也保守，与VNC无显著差异（P=0.029）。

**5. 神经索的性别差异**
图谱中4.3%的细胞在48 h.a.p.f.显示性别差异丰度，雄性富集细胞多为次级神经元（81%），雌性富集细胞多为初级神经元（78%），与fruitless（fru）和doublesex（dsx）表达相关。在MANC和FANC连接组中验证了6个半谱系-体节组合的性别差异，其中08B-T1和08B-T2数值差异最大。通过连接组匹配，将fru?神经元映射到特定克隆，如vPr-l，发现大多数为雄性特异性，仅两个类型（每侧3个神经元）在两性间共享。发育分析显示，雌性中rpr促凋亡基因在24 h.a.p.f.上调，导致雄性特异性神经元在雌性中逐渐丢失。在01A-T1半谱系中，fru?神经元显示性别分离，差异表达基因包括beat、side、dpr等突触伙伴匹配功能基因。分子距离随时间增加，表明性别二态性通过雌性特异性凋亡和转录分歧两种策略在发育中涌现。

**总结讨论与结论**
该图谱为研究果蝇神经索中数千种细胞类型的分子逻辑提供了平台，与大脑中聚焦图谱用于理解嗅觉和视觉回路特异性的方式类似。通过顺序注释初级/次级神经元、半谱系、体节和fru表达，实现了图谱与连接组的链接。对fru?神经元中性别二态性的比较分析将交叉匹配细化到仅3个神经元，表明图谱包含足够信息用于精确连接组细胞类型识别。数据表明，幼虫期出生的神经元分子谱比胚胎期更渐进分化，可能与Imp/Syp梯度相关。17个shTFs编码神经元出生顺序的持久分子时间戳，可能作为关键中介将时间起源转化为身份。该shTF代码在脑和VNC中保守，类似于哺乳动物脊髓中最近描述的共享转录代码，提示进化保守的时间逻辑。许多额外见解仍潜伏于图谱中，该图谱将成为果蝇神经科学界及跨门类比较研究的宝贵资源，并为获取相应高覆盖度发育脑图谱以完成果蝇中枢神经系统分子描述提供强烈动机。