空腹及脂质吸收期间细胞外囊泡向肠系膜淋巴的分泌

《Journal of Extracellular Biology》：Secretion of Extracellular Vesicles Into the Mesenteric Lymph During Fasting and Lipid Absorption

　　

肠道在营养稳态与全身健康中发挥关键作用。小肠是将膳食脂质包装为乳糜微粒（chylomicrons）并分泌入肠系膜淋巴的主要器官。细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）作为细胞间通讯机制常具器官特异性，但肠道向肠系膜淋巴这一独特生物流体分泌EVs尚属未知。为表征肠源性EVs，研究人员对Sprague-Dawley大鼠行肠系膜淋巴导管（用于淋巴收集）与十二指肠（用于脂质输注）插管术，收集淋巴液评估EV分泌。输注前后淋巴EVs经透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析及抗CD63、CD81、CD9与载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）抗体的流式细胞术鉴定。脂质输注使淋巴甘油三酯输出于2 h达峰值；淋巴EVs直径20–300 nm，CD63、CD81、CD9信号于脂质输注后显著升高；去除乳糜微粒对三者的阳性率与强度影响各异；ApoB+颗粒中CD63与CD81中位荧光强度显著高于CD9。结论：肠系膜淋巴EVs可快速响应脂质供给，EVs可能结合并与乳糜微粒共分泌，活跃脂质吸收期的肠源性EVs含多个与乳糜微粒亲和力不同的亚型。该研究确立肠道为EV分泌器官、肠系膜淋巴为含EVs的重要生物流体，为肠源性EVs功能研究开辟新途径。

研究背景方面，肠道维持能量稳态且分泌多种因子调节全身生理，其功能障碍与2型糖尿病、肥胖等代谢病相关。EVs是由脂质双层包被、不能自主复制的异质颗粒，按发生机制分外泌体、微囊泡等，按尺寸分小EVs（<200 nm）与大EVs（>200 nm），MISEV建议优先使用包容性术语“EVs”。肝脏、脂肪、肌肉等器官的EV分泌已被研究，但肠道作为EV分泌器官在器官水平尚未被探讨；既往EV研究集中于血液、尿液、母乳等生物流体，淋巴（尤其是器官引流淋巴）因采集困难而几近空白。小肠吸收长链脂肪酸后于肠上皮细胞将脂质包装为乳糜微粒（含ApoB-48）经肠系膜淋巴入血，该淋巴还可能运载GLP-1等分子，但是否运载肠源性EVs未知。为此，研究人员利用肠系膜淋巴导管插管技术获取大鼠“液体活检”，在空腹与十二指肠内脂质负荷两种状态下评估肠源性EV分泌。

主要关键技术方法方面，研究采用雄性Sprague-Dawley大鼠（200–350 g）队列，隔夜禁食后行十二指肠与肠系膜淋巴导管双插管，随机接受Intralipid 20%脂质团注或生理盐水对照；淋巴液按输注前1 h基线及输注后每小时收集至4 h，离心去细胞碎片得无细胞淋巴；EV分离先经20000 g两次漂浮去除乳糜微粒，再100000 g两次超离富集EVs；表征手段包括透射电子显微镜（TEM）负染观察形态、纳米颗粒追踪分析（NTA）测粒径分布、Western blot检Flotillin-1/GAPDH/Nucleoporin p62、醛基/硫酸盐乳胶微珠偶联EV的流式细胞术（FCM）检CD63/CD81/CD9及ApoB，并以0.1% SDS或Triton-X作去膜对照，淋巴甘油三酯（TG）用商用试剂盒测定，统计用双向ANOVA或混合效应模型加Tukey多重比较。

研究结果部分，3.1节“Lipid Infusion Increases Lipid Secretion From the Intestine”显示脂质输注使淋巴流速、TG浓度与TG输出较盐水组升高，2 h达峰，故取输注后2 h为脂质负荷分析时点。3.2节“The Intestine Secretes EVs Into Mesenteric Lymph”中，Western blot示EV富集物含Flotillin-1与GAPDH而不含核标记Nucleoporin p62；TEM见20–300 nm囊泡样结构；NTA主峰30–300 nm，0.1% SDS处理使颗粒数骤降一个数量级，证实为膜包被EVs。3.3节“Lipid Absorption Increases the Secretion of CD63⁺ and CD81⁺ EVs From the Intestine”通过FCM发现盐水组CD9阳性率下降而CD63/CD81稳定；脂质组CD63与CD81的阳性率及中位荧光强度（MFI）均显著升高，CD9仅MFI升高、阳性率不变，表明脂质吸收选择性上调CD63⁺/CD81⁺ EV分泌。3.4节“Chylomicron Depletion Has Differing Effects on CD63⁺, CD81⁺ and CD9⁺ EVs”将脂质后淋巴分乳糜微粒层与去乳糜微粒层，去乳糜微粒后未知大颗粒群消失，CD9阳性率趋升而CD63/CD81阳性率趋降、CD81 MFI显著上升，说明各EV亚型与乳糜微粒解离程度不同。3.5节“CD63, CD81 And CD9 Expressions Differ on ApoB⁺ Particles”显示在ApoB⁺颗粒上可检CD63与CD81但几乎无CD9，且CD63/CD81的MFI高于CD9，提示EV亚型对乳糜微粒亲和力存在差异，去乳糜微粒可能同时移除特定EV亚群。

讨论与结论翻译部分，研究人员指出既往肝、脂肪、肌肉EV分泌及血/尿/乳EV已有研究，但肠道器官水平EV分泌属首次在体证实；肠系膜淋巴低DPP-4活性使GLP-1富集，也可能保护EVs免遭某些修饰。FCM在脂蛋白背景下检出CD63/CD81/CD9证明肠源性EV存在，脂质吸收快速改变EV标记谱，可能与肠上皮细胞对营养的适应及四跨膜蛋白（tetraspanins）在EV生物发生中的差异作用有关。由于脂蛋白与EVs在尺寸、密度、组分重叠，分离具技术难度，且EV表面蛋白冠（protein corona）或与功能相关，不应一概视为污染；本研究ApoB⁺颗粒上CD63/CD81阳性而CD9阴性，与Kowal等报道的CD63/CD81共富集或CD9独富集的EV亚群一致。结论原文意译如下：本研究借助肠系膜淋巴采集专用技术确立EVs存在于肠系膜淋巴液中，且肠道EV分泌可快速响应脂质吸收；脂质吸收期肠源性EVs在正常生理条件下可能包含多个与乳糜微粒亲和力不同的亚型；这些发现为未来在病理状态及其他营养素刺激下考察肠源性EV分泌、并表征其功能开辟了新路径。论文发表于《Journal of Extracellular Biology》。