S100A9通过TLR4/PGC-1α介导的巨噬细胞-肌成纤维细胞交互作用加重心脏纤维化

《Journal of Extracellular Vesicles》：S100A9 Aggravates Cardiac Fibrosis by TLR4/PGC-1α Mediated Macrophage-Myofibroblast Crosstalk

　　

纤维化是心肌缺血后心室重构的关键组成部分，心脏成纤维细胞的激活和扩增是这一过程的主要驱动因素。研究人员先前的研究确定了S100A9依赖的巨噬细胞-肌成纤维细胞转化（MMT）作为心肌缺血再灌注（MIR）后心脏中肌成纤维细胞的一个新来源。然而，S100A9调控MMT的机制尚不完全清楚。本研究利用多种基因工程小鼠模型、MIR和心肌梗死（MI）模型以及体外多细胞共培养系统，研究了S100A9在MMT过程中调控成纤维细胞来源的迁移体（migrasome）释放中的作用。研究人员发现，巨噬细胞来源的S100A9通过MIR后的TLR4/PGC1α信号通路促进心脏成纤维细胞的线粒体功能障碍和迁移体释放。这些成纤维细胞来源的迁移体进而激活巨噬细胞中的整合素/Src信号，触发MMT并加速心脏纤维化。重要的是，研究人员阐明了巨噬细胞来源的S100A9如何协调成纤维细胞与免疫细胞之间的交互作用，并确定了迁移体介导的MMT激活是驱动MIR后纤维化重构的一个先前未被认识的机制。研究人员的发现表明，靶向S100A9诱导的迁移体释放及其下游MMT信号可能是一种有前景的治疗策略，以减轻病理性心脏纤维化。

**研究背景与问题**

心脏纤维化是心肌缺血后心室重构的关键病理过程。虽然适度纤维化有助于维持心室结构完整性，但过度纤维化会导致心脏僵硬、适应不良性重构乃至心力衰竭。肌成纤维细胞是驱动心脏纤维化的主要效应细胞，其来源包括成纤维细胞转化和巨噬细胞-肌成纤维细胞转化（MMT）。已有研究报道MMT存在于心脏、肺、肾等器官纤维化中，但MMT的调控机制及其在心脏纤维化中的病理意义尚未完全阐明。S100A9是一种由髓系巨噬细胞释放的损伤相关分子模式蛋白，研究人员先前发现其介导的MMT是心肌缺血后肌成纤维细胞的新来源，但S100A9调控MMT的具体分子机制仍不清楚。该论文发表在《Journal of Extracellular Vesicles》上，旨在揭示S100A9通过促进成纤维细胞释放迁移体（migrasome）来驱动MMT并加重心脏纤维化的机制。

**主要技术方法**

本研究采用的技术方法包括：1）多种基因工程小鼠模型（全身性S100a9敲除S100a9^KO和巨噬细胞特异性S100a9敲除S100a9^MKO）以及心肌缺血再灌注（MIR）和心肌梗死（MI）模型；2）体外原代细胞（小鼠心脏成纤维细胞、骨髓来源巨噬细胞BMDM）分离培养与多细胞共培养系统（Transwell小室，不同孔径）；3）迁移体分离纯化（差速离心联合密度梯度超速离心）及鉴定（Western blot、透射电镜TEM、WGA染色）；4）单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据分析（GSE227088数据集）；5）线粒体功能检测（ROS、线粒体膜电位MMP、耗氧率OCR、细胞外酸化率ECAR、ATP、mtDNA）；6）流式细胞术（MMT细胞鉴定F4/80⁺α-SMA⁺）；7）免疫荧光与Western blot；8）药物干预（S100A9中和抗体NTAB、Tasquinimod、SAR407899、ATN-161等）。样本队列来源：人类外周血样本来自中国科学技术大学附属第一医院心内科24小时内接受冠状动脉再通的急性心肌梗死患者及健康对照。

**研究结果**

**3.1 S100A9促进MMT并加重心脏纤维化进展**：通过S100a9^KO和S100a9^MKO小鼠模型，MIR后第7天Masson染色显示心脏纤维化面积显著减少；KIKGR-Lyz2Cre报告小鼠追踪巨噬细胞，证实MMT发生，且S100a9缺失减少α-SMA⁺巨噬细胞数量；WGA染色显示心肌细胞肥大减轻；超声心动图显示左心室射血分数（LVEF）和缩短分数（FS）改善；Western blot表明迁移体相关标志物表达下调。MI模型中也得到一致结果。

**3.2 重组S100A9蛋白增强MMT并加重心脏纤维化**：向MIR小鼠静脉注射重组S100A9（rS100A9，每48小时一次）后，WT和S100a9^MKO小鼠纤维化面积增加、心肌细胞肥大加重、心功能恶化；MMT水平升高，迁移体相关分子上调。

**3.3 中和S100A9减轻MMT并保护心脏免受纤维化**：MIR后给予S100A9中和抗体（NTAB）治疗，与同型对照相比，纤维化面积减少、心肌细胞肥大减轻、心功能改善；MMT水平降低，迁移体相关分子表达下降。MI模型结果一致。

**3.4 S100A9促进成纤维细胞迁移、激活和迁移体释放**：原代心脏成纤维细胞经rS100A9刺激后，迁移能力增强（Transwell实验），激活标志物Col1α1和迁移体标志物Integrin α5表达上调；线粒体功能受损（mtDNA减少、OXPHOS复合体I/IV下降、ROS升高、MMP降低、OCR和ATP减少，ECAR无显著变化）；WGA染色和TEM证实迁移体释放增多；Tspan4敲低显著减少rS100A9诱导的迁移体释放而不影响外泌体标志物。

**3.5 S100A9通过TLR4/ERK/PGC-1α通路诱导成纤维细胞线粒体功能障碍和迁移体释放**：rS100A9降低PGC-1α表达；在成纤维细胞-巨噬细胞共培养中，过表达PGC-1α可减弱rS100A9刺激的成纤维细胞诱导的巨噬细胞纤维化表型；TLR4抑制剂（TAK242）恢复PGC-1α水平、改善线粒体功能并抑制迁移体释放；p-ERK抑制剂（UO126）同样升高PGC-1α并抑制迁移体释放；Tlr4或Erk1/2敲低后，rS100A9诱导的p-ERK上调、PGC-1α下降及迁移体释放均被阻断；NFκB或TNFα敲低不影响迁移体释放，表明炎症通路不参与该过程。

**3.6 S100A9促进成纤维细胞释放迁移体，进而增强MMT**：在成纤维细胞-巨噬细胞共培养体系中，仅rS100A9刺激的成纤维细胞能诱导巨噬细胞MMT；迁移体抑制剂SAR407899和0.4 μm孔径Transwell阻断迁移体转移后，MMT效应消失；Tspan4敲低同样减少MMT。

**3.7 成纤维细胞来源的迁移体通过整合素α5/Src信号诱导MMT**：纯化的迁移体处理巨噬细胞后，α-SMA、Src和p-smad3表达升高；整合素α5抑制减弱该效应，而Src过表达可逆转；体内给予整合素α5抑制剂（ATN-161）后，MIR和MI小鼠纤维化面积减少、心功能改善、MMT水平降低；28天随访显示存活率提高、纤维化减轻；巨噬细胞中整合素α5敲低减弱迁移体诱导的MMT。

**3.8 药理学抑制S100A9减轻MMT并保护心脏纤维化**：MIR后6小时和24小时给予S100A9抑制剂Tasquinimod，纤维化面积减少、心肌细胞肥大减轻、心功能改善；MMT水平降低。人类样本中，急性心肌梗死患者血清S100A9水平显著升高；其外周血单核细胞与rhS100A9刺激的人成纤维细胞共培养后，MMT相关分子表达上调。

**讨论与结论**

讨论部分指出，该研究揭示了一个先前未被认识的机制：巨噬细胞来源的S100A9通过激活成纤维细胞TLR4/p-ERK/PGC-1α信号，诱导成纤维细胞激活、迁移和迁移体释放；这些迁移体随后被巨噬细胞摄取，通过整合素α5/Src信号促进MMT，最终加速心脏纤维化。整合素α5在体内抑制可显著减少纤维化、改善心室重构，提示靶向S100A9诱导的迁移体释放及下游MMT信号具有治疗潜力。但研究存在局限性：缺乏人类心肌样本验证，以及需要大规模临床研究确认整合素α5抑制对心肌梗死患者的有益效应。

结论部分翻译：本研究显示，浸润的髓系巨噬细胞在心肌缺血后释放S100A9，激活心脏成纤维细胞中的TLR4/p-ERK信号，增强线粒体mtROS产生并损害氧化呼吸链功能。这些代谢改变驱动成纤维细胞分化为迁移性肌成纤维细胞，并促进迁移体释放。迁移体作用于巨噬细胞，通过整合素α5/Src信号诱导其转分化为肌成纤维细胞样细胞，从而加剧心脏纤维化。总之，研究人员的发现确定了一个先前未被认识的S100A9-迁移体-整合素α5轴，该轴连接了巨噬细胞激活与成纤维细胞重编程，并促进了缺血后纤维化重构。