CfSnt2-CfRpd3介导的H3去乙酰化调控ROS诱导的自噬和果生刺盘孢的致病性

《Molecular Plant Pathology》：CfSnt2-CfRpd3-Mediated H3 Deacetylation Governs the ROS-Induced Autophagy and Pathogenicity of Colletotrichum fructicola

　　

活性氧（ROS）作为植物中的关键免疫因子，抵御病原体感染，但病原真菌是否通过自噬响应宿主来源的ROS仍不清楚。研究人员先前发现CfSnt2介导的H₃去乙酰化调控果生刺盘孢（Colletotrichum fructicola）中的自噬和对氧化应激的响应，果生刺盘孢是一种感染超过50种作物的广泛分布的病原真菌。然而，具体的调控机制尚不清楚，特别是氧化应激如何与自噬相联系。在此，研究人员提供了证据表明自噬在果生刺盘孢感染和氧化应激期间被高度诱导。研究人员进一步对CfSnt2互作蛋白进行了质谱（MS）分析，并鉴定出组蛋白去乙酰化酶CfRpd3进行功能表征。研究人员发现CfRpd3主要定位于细胞核，并与CfSnt2协同调控组蛋白H₃去乙酰化。此外，研究人员证明CfRpd3和CfSnt2都是自噬抑制因子，在ROS诱导的自噬过程中其表达下调。靶向基因敲除CfRPD3产生了ΔCfrpd3突变体，该突变体在生长、产孢、附着胞形成和对氧化应激的响应方面表现出缺陷，与ΔCfsnt2突变体中观察到的缺陷相似。这些综合效应导致其致病性缺陷。总之，研究人员的研究揭示了一种新机制，即CfSnt2-CfRpd3介导的H₃去乙酰化精确协调自噬以调控果生刺盘孢中的ROS响应和致病性。

**论文解读：CfSnt2-CfRpd3介导的H3去乙酰化调控ROS诱导的自噬与果生刺盘孢致病性**

**研究背景与问题**

油茶炭疽病由果生刺盘孢（*Colletotrichum fructicola*）引起，严重威胁油茶产量与品质。活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是植物抵御病原真菌入侵的最早免疫因子之一，但病原真菌如何通过自噬（autophagy）响应宿主来源的ROS，其分子机制尚不明确。研究人员前期发现，组蛋白乙酰化相关蛋白CfSnt2通过介导组蛋白H3去乙酰化调控自噬和ROS应答，但CfSnt2本身不含去乙酰化酶结构域，其具体调控机制，特别是氧化应激与自噬之间的连接方式，仍不清楚。因此，本研究旨在阐明CfSnt2如何协同组蛋白去乙酰化酶，将ROS信号与自噬过程联系起来，并影响病原菌的致病性。

**研究内容与结论**

研究人员以果生刺盘孢野生型菌株CFLH16为材料，首先证实自噬在侵染油茶叶片和H₂O₂胁迫下被高度诱导。通过免疫共沉淀联合质谱（MS）分析，鉴定出CfSnt2的互作蛋白——组蛋白去乙酰化酶CfRpd3，并利用免疫共沉淀（Co-IP）、体外pull-down和酵母双杂交（Y2H）实验验证了二者之间的直接相互作用。进一步研究发现，CfRpd3主要定位于细胞核，与CfSnt2共同介导组蛋白H3的去乙酰化。功能分析表明，CfRpd3和CfSnt2均为自噬抑制因子，在ROS诱导自噬过程中，二者的转录水平显著下调，从而解除对自噬的抑制。靶向敲除CfRPD3获得的ΔCfrpd3突变体，在营养生长、产孢、附着胞形成、ROS胁迫响应及渗透胁迫响应等方面均表现出与ΔCfsnt2突变体相似的缺陷，并完全丧失对油茶和苹果的致病性。该研究揭示了CfSnt2-CfRpd3通过H3去乙酰化精确调控ROS诱导的自噬，进而影响病原菌致病性的新机制，论文发表在《Molecular Plant Pathology》。

**关键技术方法**

研究人员主要采用以下关键技术：（1）免疫共沉淀联合质谱（Co-IP/MS）鉴定CfSnt2互作蛋白；（2）体外pull-down与酵母双杂交（Y2H）验证蛋白直接互作；（3）靶向基因敲除与回补（利用同源重组和原生质体转化，以潮霉素抗性基因替换目标基因）；（4）荧光显微镜观察GFP-CfAtg8标记的自噬流及CfRpd3-GFP的亚细胞定位；（5）Western blot检测GFP-CfAtg8降解与组蛋白H3乙酰化水平；（6）反转录定量PCR（RT-qPCR）分析基因表达；（7）致病性测定（接种油茶离体叶片和苹果果实）；（8）生长、产孢、附着胞形成及胁迫响应分析。样本来源为果生刺盘孢野生型菌株CFLH16及其衍生突变体。

**研究结果**

**2.1 与油茶互作或ROS胁迫诱导果生刺盘孢自噬**
通过Western blot检测GFP-CfAtg8的降解，发现与油茶叶片互作早期及H₂O₂处理后，游离GFP增加，自噬流增强；荧光显微镜观察也证实H₂O₂处理后GFP信号在液泡中积累，表明自噬被诱导。

**2.2 CfSnt2与组蛋白去乙酰化酶CfRpd3互作**
质谱分析鉴定出CfRpd3为CfSnt2的候选互作蛋白。Co-IP试验证实CfRpd3-Flag可捕获GFP-CfSnt2；AlphaFold3分子对接模型显示两蛋白间存在79个氢键相互作用；体外pull-down和Y2H进一步证明CfSnt2的ELM2-SANT结构域与CfRpd3直接互作。

**2.3 CfRpd3主要定位于细胞核并介导组蛋白H3去乙酰化**
CfRpd3-GFP与核标记蛋白H1-RFP共定位，主要分布于菌丝和分生孢子的细胞核，部分胞质也有信号。与野生型相比，ΔCfrpd3突变体中H3K9、H3K18和H3K56位点的乙酰化水平显著升高，表明CfRpd3介导H3去乙酰化。

**2.4 CfRpd3和CfSnt2负调控ROS相关自噬**
在H₂O₂处理下，ΔCfrpd3和ΔCfsnt2突变体中含GFP液泡的比例及游离GFP比例均显著高于野生型，表明自噬增强。RT-qPCR显示ΔCfrpd3突变体中多数自噬相关基因上调表达，且CfRPD3和CfSNT2在ROS诱导自噬过程中转录下调。突变体对自噬诱导剂雷帕霉素的敏感性也增加。

**2.5 CfRpd3参与ROS胁迫和渗透胁迫响应**
ΔCfrpd3突变体在5 mM H₂O₂下生长抑制率显著高于野生型，且氧化还原相关基因转录在H₂O₂处理后未能有效上调；突变体对KCl和NaCl诱导的渗透胁迫表现出更强的抗性。

**2.6 CfRpd3对生长和营养利用重要**
ΔCfrpd3突变体在PDA、CM和MM培养基上生长均显著减慢，且在营养最丰富的CM上生长最慢，在营养贫乏的MM上生长最快。添加酪蛋白氨基酸、酵母提取物或蛋白胨可抑制突变体生长，而维生素无此效应，表明CfRpd3参与氮源利用。

**2.7 CfRpd3对致病性必不可少**
ΔCfrpd3突变体在油茶离体叶片（有伤和无伤）及苹果上均不能形成病斑，完全丧失致病性，而野生型和回补菌株引起典型病斑。

**2.8 敲除CfRPD3影响产孢并破坏附着胞形成**
ΔCfrpd3突变体产孢量极少，分生孢子长度显著缩短，且不能形成附着胞，而野生型和回补菌株正常产孢且附着胞形成率超过60%。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次直接证明植物病原真菌在侵染过程中可通过自噬响应宿主ROS胁迫。CfSnt2通过其ELM2-SANT结构域招募组蛋白去乙酰化酶CfRpd3，共同介导H3去乙酰化，从而抑制自噬相关基因的转录，负调控ROS诱导的自噬。当ROS水平升高时，CfRPD3和CfSNT2表达下调，解除对自噬的抑制，以维持ROS稳态和正常致病性。此外，CfRpd3的胞质定位提示其可能具有非组蛋白去乙酰化靶标，这或可解释突变体在营养利用上的异常。研究结论重申：研究人员鉴定出CfSnt2-CfRpd3复合体通过H3去乙酰化抑制ROS诱导的自噬，而在感染和氧化应激期间，通过下调自身表达来解除这种抑制，从而调控ROS响应和致病性。