综述：利用自然多样性与理性设计增强植物免疫

《Plant, Cell & Environment》：Harnessing Natural Diversity and Rational Design for Enhanced Plant Immunity

　　

植物病原菌引致作物减产。通过自然遗传多样性或工程抗性获得的遗传抗性，在保护植物免受侵染方面极具成效。源于作物野生近缘种的抗性已成功导入作物以控制病原菌侵染。自然遗传多样性亦被用于解析免疫的分子机制。得益于结构与计算生物学的进展，病原菌识别可通过理性设计手段加速实现。研究人员着重关注间接识别病原菌的自然与工程多样性，即病原菌修饰宿主蛋白且该修饰被植物免疫受体所侦测，此类识别系统在细菌病原菌抗性中尤为普遍。研究人员从三个尺度探讨间接识别的自然遗传多样性：（1）跨物种；（2）物种内；（3）个体内。最后，研究人员将这些见解拓展至植物—病原菌识别理性工程的方法中。

1 引言

植物病原菌造成严重的农业损失，威胁全球粮食安全。化学防治常对人类及环境健康有害。培育抗病作物是应对粮食不安全并减轻农业危害的重要途径。对于栽培种或野生近缘种中具有群体水平抗性的作物，可利用自然多样性通过育种或生物技术将抗性基因导入（Nelson等，2018）。然而，面对无显著群体抗性的新发病原菌威胁，亟需新型作物抗性策略（Ristaino等，2021）。通过细胞内免疫受体识别病原菌是一种高效且持久的策略。

2 植物先天免疫

2.1 植物免疫系统概述

植物拥有先天免疫系统，通过两个相互关联的层级实现病原识别。在细胞表面，模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）通常识别病原菌相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），如鞭毛蛋白，介导模式触发免疫（pattern-triggered immunity, PTI）（Jones和Dangl，2006）。PTI信号经受体样胞质激酶（receptor-like cytoplasmic kinases, RLCKs）向细胞内转导，引发胞内Ca²⁺爆发、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生、转录改变及胼胝质沉积以加固细胞壁（Couto和Zipfel，2016）。部分植物病原菌（如细菌性病原菌丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae）具有III型分泌系统（type III secretion system, T3SS），可穿透植物细胞壁与膜，将III型分泌效应子（type III secreted effectors, T3SEs）注入植物细胞（Alfano和Collmer，2004；He等，2004；Tang等，2006）。T3SEs通常通过抑制PTI促进毒力（Alfano和Collmer，2004；Jones和Dangl，2006）。例如，P. syringae 分泌多种T3SEs，包括AvrPphB，其通过切割RLCK信号组分抑制鞭毛蛋白触发的PTI（Zhang等，2010）。作为第二层抗性，植物拥有细胞内核苷酸结合亮氨酸重复受体（nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors, NLRs），可识别T3SEs。当NLRs在效应子存在下被激活，则介导效应子触发免疫（effector-triggered immunity, ETI），常伴随称为超敏反应（hypersensitive response, HR）的程序性细胞死亡（Zhang等，2010；Heath，2000）。HR能有效限制病原菌在植物局部扩散。

尽管曾认为PTI与ETI独立运作，近期研究揭示了二者间的交叉对话。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，两个不同P. syringae 效应子通过ETI产生的抗性仅在PTI同时启动时才发生（Ngou等，2021；Yuan等，2021）。PTI似乎是ETI充分激活所必需的，反之亦然：当T3SEs诱导ETI时，对P. syringae 鞭毛蛋白PAMP的PTI响应增强（Ngou等，2021）。此外，过表达NLR特异性E3连接酶导致NLR积累减少，损害PTI（Tian等，2021）。ETI后PTI组分的转录亦上调（Ngou等，2021；Yuan等，2021）。植物在PTI与ETI共同激活时方能获得最有效免疫（Yuan等，2021）。

2.2 植物NLR分类、识别模型与信号传导

植物NLRs通常依据N端信号域分为三大类。所有典型NLRs均具C端亮氨酸富集重复（leucine-rich repeat, LRR）域及中央核苷酸结合Apaf-1、R蛋白、Ced-4（NBARC）域。典型NLRs在N端含卷曲螺旋（coiled coil, CC）、Toll/白细胞介素1受体（TIR）或抗白粉病8类卷曲螺旋（CC_R）域。CC域架构跨物种存在差异，包括茄科域（Solanaceae-domain, SD）型CC域及茄科I2样CC域（Wang等，2021）。NLRs亦可含非典型“整合域”参与效应子识别或信号传导（Baggs等，2017）。依N端域，NLRs分为CC-NLRs（CNLs）、TIR-NLRs（TNLs）或CC_R-NLRs（RNLs）。RNLs常称“辅助”NLRs，由“传感器”TNL或CNL激活后发挥作用（Jubic等，2019）。CNLs与RNLs见于所有被子植物，而TNLs在单子叶植物中缺失（Jacob等，2013；Shao等，2016）。虽多NLRs以传感器—辅助对形式功能，部分NLRs（如ZAR1与RPM1）不依赖辅助NLR介导ETI（Saile等，2020）。激活后，RNLs、TNLs及CNLs形成高阶寡聚结构，致构象变化并激活N端域及下游信号。

为检测病原菌并触发ETI，NLRs可监控宿主蛋白的T3SE修饰，或直接互作T3SEs。直接NLR-T3SEs识别多为基因对基因配对，即一NLR识别特异T3SE（Jones等，2016）。虽原始模型视基因为基因识别为主流（Flor，1971），近期研究表明此模型在细菌病原菌中属例外（Laflamme等，2020）。更常见策略是通过一个或多个NLRs监控PTI组分或其模拟物（Laflamme等，2020），即间接T3SE检测，或称守卫模型：宿主蛋白被NLRs“守卫”。守卫宿主蛋白包括PTI组分及无明显功能的“诱饵”蛋白（Jones等，2016）。例如，RLCKs为PTI重要信号组分（Zhang等，2010），常为效应子靶标（Schreiber等，2021）。因此若干NLRs守卫RLCKs，如拟南芥ZAR1、RPS5及番茄Prf（Lewis等，2013；Mucyn等，2009；Shao等，2003）。宿主蛋白亦可由含非典型整合域（NLR-IDs）的NLRs监控（Jones等，2016）。NLR-IDs中整合域模拟T3SE靶标并被直接修饰（Baggs等，2017；Marchal等，2022）。修饰后，NLR-IDs通常经缺ID的附加NLR介导ETI（Baggs等，2017；Marchal等，2022）。直接间接识别均致复杂下游信号。

下游ETI信号依赖激活的NLR类别。TNLs（RPP1、Roq1）识别效应子后形成同源四聚体（Ma等，2020；Martin等，2020）。寡聚化时TIR域联合产生NADase活性位点，生成多种小分子（Huang等，2022；Jia等，2022；Ma等，2020；Manik等，2022；Yu等，2022）。这些小分子结合SAG101与EDS1，进而与RNLs（如NRG1A或PAD4）互作，后者与ADR1等RNLs互作，致免疫激活与钙内流（Huang等，2025；Wu等，2024；Xiao等，2025；Yu等，2024）。CNLs（ZAR1、Sr35）激活形成同源五聚体（F?rderer等，2022；Wang等，2019）。ZAR1与Sr35中CC域联合形成膜关联非选择性阳离子通道，促钙等多阳离子内流（Bi等，2021；F?rderer等，2022）。CC_R与CC域结构相似（Jacob等，2021）。RNLs激活亦成高阶寡聚并作为膜关联阳离子通道（Jacob等，2021）。部分NLRs（如ZAR1、RPM1）不依赖RNLs，但仍部分依赖全局TIR传感器信号，提示NLR信号可增强他种非辅助NLR激活（Jacob等，2023）。

本文聚焦利用自然蛋白多样性解析效应子间接识别分子机制、理性设计病原菌识别的进展及未来强调工程化新型间接识别的依据，侧重间接识别系统在作物育种抗细菌病害中的优势，并从三尺度探讨：跨物种、物种内、个体内自然多样性，并延伸至理性工程途径。

3 利用自然多样性理解间接识别分子机制

3.1 跨物种自然多样性

植物常具数百NLRs，物种间、种群间高度多样（Jacob等，2013；Shao等，2016；Van de Weyer等，2019）。高通量NLR多样性赋予近缘种及种内广泛免疫多样性。通过挖掘自然NLR多样性，可鉴定并导入抗性。经典例证为番茄野生种醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）Pto/Prf 簇成功导入栽培番茄（Pitblado和Macneill，1983）。该簇于1930年代导入，抗P. syringae 0小种。AvrPto与AvrPtoB靶向PTI组分，而RLCKs（Pto、Fen）模拟靶标；Prf守卫Pto与Fen致识别（Gutierrez等，2010；Mathieu等，2014；Mucyn等，2009；Ntoukakis等，2013）。

NLR多样性及拷贝数变异使跨物种鉴定直系同源困难。NLR跨物种转移可致自身免疫或失效（Ade等，2007；Chen等，2014；Day等，2005；Hurni等，2014；Jeuken等，2009）。间接识别宿主因子亦呈跨物种变异（Adachi等，2023；Gong等，2022；Kim等，2022）。异源表达间接识别NLRs因缺守卫抑制致HR自发激活（Ade等，2007；Day等，2005；Jeuken等，2009）。如拟南芥RPS2因其守卫蛋白RIN4被效应子降解而激活（Axtell和Staskawicz，2003；Day等，2005；Mindrinos等，1994）；在本氏烟（Nicotiana benthamiana）瞬表致自发HR，因其RIN4直向同源不足抑RPS2（Day等，2005）。

广布被子植物NLR——ZAR1为例外。ZAR1直向同源近存所有真双子叶植物且功能保守（Adachi等，2023；Gong等，2022；Lewis等，2010）。拟南芥ZAR1守卫RLCK（ZED1），HopZ1a修饰ZED1触发ETI（Lewis等，2013；Lewis等，2010）。ZED1在本氏烟瞬表可经本氏烟ZAR1（NbZAR1）识HopZ1a（Baudin等，2017）。ZAR1与ZRKs多样性利于机制解析（Diplock等，2023）。九ZAR1直向同源异源表达示可变自发HR（Gong等，2022）；拟南芥13 ZRKs中2个致本氏烟ZAR1自发激活（Diplock等，2023）。ZED1突变库揭示ZAR1直向同源功能分化、自发活性分子机制及保识别灭自发之可能（Diplock等，2024）。两ZED1突变损AtZAR1识HopZ1a却不损NbZAR1；暗示AtZAR1需更多ZED1乙酰化残基。定点突变灭NbZAR1自发而不损识别，并拓展番茄ZAR1识HopZ1a（Diplock等，2024）。抑自发另策包括诱导启动子、组织特异表达或共表负调因子（Gong等，2025；Xu等，2017；Zhu等，2023）。

RPS2-RIN4系统跨物种缺席。本氏烟无RPS2及适RIN4等位（Day等，2005）。大豆有四RIN4样蛋白介RPG1-B间接识AvrRpm1（Selote和Kachroo，2010）；GmRIN4b补拟南芥rin4突变识AvrRpm1，GmRIN4a不能（Selote和Kachroo，2010）。苹果MdRIN4介MR5识Erwinia amylovora 效应子AvrRpt2（Prokchorchik等，2020）。比析定AtRIN4^N158与AtRIN4^Y163为互作调控关键，RSM基序决NLR兼容（Kim等，2022）。

PBS1为RPS5守卫RLCK，被AvrPphB切割激活。其SEMPH基序必于识别（见3.3）。小麦TaPBS1为STRPH，不激拟南芥RPS5；换SEMPH则恢复（Sun等，2017）。小麦大麦PBS1同源用于探RPS5底物特异（Carter等，2019；Sun等，2017），并成理性设计先例。

3.2 物种内自然多样性：拟南芥生态型

利用种内自然多样性鉴抗为育咱常规（Nelson等，2018）。拟南芥千基因组及重组自交系为泛基因组与表型关联资源（Weigel和Mott，2009；Wilson等，2001）。

生态型抗性变异可用全基因组关联分析（GWAS）定位机制。Auon等筛176份拟南芥抗青枯菌（Ralstonia solanacearum）高热抗，获RRS1-R/SSL4位点（Aoun等，2017）。RRS1-R含WRKY整合域靶效应子（Le Roux等，2015）。Huard-Chauveau等用Col-5×Kas-1 RILs及381份GWAS获ZRK家族RKS1，涉AvrAC识（Huard-Chauveau等，2013；Wang等，2015）。Baudin等筛近300生态型ZAR1-HopZ1a HR，依千基因组优先测非冗余等位，鉴互作必需残基（Baudin等，2021）。Barragan等交80生态型作图获RPP7与RPW8不兼容致坏死，RPW8 C端重复长度差为主因（Barragan等，2019）。

自然多样性亦研广谱抗性进化。Montes等示黄瓜花叶病毒选压拟南芥天然种群，且抗性与气候生活史无关（Montes等，2019）。Glander等比对示免疫组分低表达等位关联短营养期（Glander等，2018）。MacQueen等评RPS2适/不适等位适合度，敲除RPS2损适合度，而RPS5/RPM1缺则降5–10%（MacQueen等，2016；Karasov等，2014）。综上，生态型多样性揭NLR代价与调控复杂性。

3.3 个体内自然多样性

个体内蛋白家族同源多样。RLCKs与NLRs家族尤高（Lehti-Shiu和Shiu，2012；Jacob等，2013）。亚麻L位点12 NLR等位抗锈菌，LRR域变决特异（Ellis等，2000；Dodds等，2006）。拟南芥RPP13、大麦MLA类似（Hall等，2009；Lu等，2016）。

细菌间接识为主（Laflamme等，2020）。ZRKs/PBLs多样介ZAR1识菌。ZAR1守卫近全ZRKs（Diplock等，2023），抗约半494 P. syringae 株（Laflamme等，2020）。RKS1静息结ZAR1；AvrAC尿苷化PBL2引RKS1-PBL2互作激ZAR1（Wang等，2015）。ZED1为HopZ1a乙酰化（Lewis等，2013）。Diplock等示ZAR1 LRR域决RLCKs互作特异，单突变强互作（Diplock等，2023）。PBS1属RLCK VII，45成员中29 PBLs。Zhang等证GDK基序必切；PBL6 D→S不切，PBL1 D→E可（Zhang等，2010）。Qi等建PBS1-PBL27嵌合示C端及SEMPH基序必于RPS5激（Qi等，2014）。

4 迈向效应子识别理性设计

间接识为NLR免疫常态。守PTI组分或模拟物使单NLR获广抗。理性设计间接识少，因需两界面（NLR-守卫-效应子），直接设计多改LRR（Tamborski等，2023；F?rderer等，2022）。整合域如HMA达多效抗：稻RGA5/Pikp-1换残基扩识（Liu等，2021；Cesari等，2022；Zhang等，2024）。薯Rpi-brk1 HMA域嵌入R1双识（Wang等，2025）。纳米抗体换Pik-1^HMA识GFP/mCherry抗病毒（Kourelis等，2023）。PBS1切位点换病毒蛋白酶获大豆薯抗病毒（Helm等，2019；Bai等，2022）。

5 结论

自然多样性阐多机制，但HR与抗关系待清。ZAR1系统可答：不同ZRKs致HR±抗（Breit-McNally等，2022）。持续探机制推理性设计。生物多样性减威胁粮安，自然多样为农抗基石，结结构与信息学将拓新防护。

致谢（略）

数据可用性（略）