西班牙干腌火腿合成二肽体内抗氧化活性证据

《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》：In Vivo Evidence of Antioxidant Activity from Dipeptides Synthesized from Spanish Dry-Cured Ham

　　

来自干腌火腿的生物活性肽因其作为潜在抗氧化功能成分的关注价值而备受关注，然而二肽对该活性的具体贡献仍鲜有表征。研究人员评估了先前在干腌火腿消化提取物中鉴定出的十种合成二肽的安全性及抗氧化能力。二肽依据其相对比例组合获得储备液（10 mg/mL），并测试0.125至2.5 mg/mL浓度。采用MTT法在人结肠直肠癌Caco-2细胞中评价细胞活力。在Caco-2与人内皮EA.hy926细胞中通过定量活性氧（ROS）及定向转录组学分析抗氧化基因表达，测定离体抗氧化活性。在急性与慢性氧化应激条件下的Caenorhabditis elegans（秀丽隐杆线虫）中评价体内抗氧化活性。该二肽组分在≤1.0 mg/mL时维持＞90%细胞活力；更高浓度使活力下降65–78%。两种细胞模型中，二肽处理较对照显著降低（P＜0.05）细胞内ROS生成，最大降低见于0.5–1.5 mg/mL。0.5 mg/mL二肽存在下Caco-2抗氧化基因谱较对照改变。在C. elegans中，二肽组分暴露提高（P＜0.05）急性与慢性氧化应激下存活率；1.5 mg/mL预处理使急性暴露后360至600 min存活率显著提升50%。慢性应激下SR50使处理组线虫存活率由3天增至5天（P＜0.05）。还观察到百草枯诱导的细胞内ROS水平显著降低（P＜0.05）及抗氧化应答关键基因（含GST-4与SOD-3）调控。综上，这些结果表明干腌火腿合成二肽（EE、IE、GA、VD、DA、DG、VG、PA、DV和ES）具有生物学相关抗氧化活性，支持其作为抵御氧化应激功能成分的应用。

研究背景与立项依据

氧化应激参与生理退化并增加慢性病风险，促使功能性食品与营养制品研究关注可调节该效应的化合物。生物活性肽（BPs）是短蛋白片段，释放后可发挥超越营养价值的生物学功能，其中抗氧化活性备受关注。多数BPs经酶解、发酵或加工由前体蛋白生成，水解物含多种共存肽序列，使单一肽贡献难以归因；已有研究显示单独合成肽的抗氧化活性常低于原分级混合物，提示肽间相加或集合效应。二肽因结构简易、在水解物中潜在丰度及已知可经肠肽转运蛋白PEPT1吸收且较长短肽更易保持完整，成为体内活性候选。前期研究通过靶向质谱结合标记合成肽校准，在西班牙干腌火腿体外消化分级中实验鉴定并定量了十种二肽（EE、IE、GA、VD、DA、DG、VG、PA、DV、ES）。本研究旨在按消化分级中相对丰度化学重构该十肽池，在受控细胞与体内模型下评价其抗氧化潜力。论文发表于《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》。

主要关键技术方法

研究样本队列来源于西班牙干腌火腿模拟胃肠消化（SGID）提取物的前期靶向定量结果，十种二肽（纯度＞99%）按相对比例化学重构为合成肽分级（SPF，10 mg/mL）。化学抗氧化采用ABTS与DPPH自由基清除法测IC₅₀；细胞安全与离体抗氧化以人Caco-2与内皮EA.hy926为模型，MTT测活力，DCFDA与DHE荧光法测ROS，定向转录组（AmpliSeq+Illumina NextSeq 2000，DESeq2）分析Caco-2基因；体内以野生型N2秀丽隐杆线虫为模型，经tBOOH诱导急性、百草枯诱导慢性氧化应激行Kaplan-Meier生存分析，DCFH-DA测线虫ROS，RT-qPCR测daf-16、sod-3、skn-1、gst-4、gst-10表达，均以ACT-1内参。

研究结果

体外抗氧化活性比较：重构SPF与原始火腿消化肽分级（HDP）在ABTS法IC₅₀无差异（P＞0.05），DPPH法SPF的IC₅₀显著更高（P＜0.05），表明选定二肽池捕获了原分级ABTS侧大部分活性，但DPPH侧可能依赖更长肽或基质协同。

Caco-2细胞毒性（MTT）：SPF至2.0 mg/mL活力约80%，＞1.0 mg/mL后下降，符合ISO 10993-5非细胞毒标准（＞70%），功能剂量安全。

细胞抗氧化研究：在Caco-2与EA.hy926中，0.5、1.0、1.5 mg/mL SPF于吡ocyanin（PYO）或抗霉素A（ANT）诱导下，DCFDA与DHE荧光显著低于氧化对照（P＜0.05），即降低H₂O₂类与超氧O₂^?水平，跨细胞类型一致。

Caco-2靶向转录组：0.5 mg/mL SPF上调HMOX1、SERPIN1、MT2A、CXCL8，下调APLN、IL1B、PPARG，呈细胞保护及炎症消退表型，HMOX1与MT2A关联氧化还原稳态。

体内急性氧化应激（C. elegans+tBOOH）：24–48 h预处理0.25–2.0 mg/mL SPF，1.0与1.5 mg/mL组存活中位由对照约350 min延至约600–650 min（P＜0.05），量效趋正。

体内慢性氧化应激（C. elegans+25 mM百草枯）：1.0 mg/mL预处理24或48 h，平均存活由对照约3天增至约5天（P＜0.001），1.5 mg/mL略增。

线虫ROS：百草枯前SPF预处理各浓度均使DCF荧光显著低于阳性对照（P＜0.05），接近阴性。

线虫抗氧化基因：RT-qPCR显示SOD-3（DAF-16/IIS通路靶）与GST-4（SKN-1/Nrf2同源靶）上调，提示同时激活DAF-16与SKN-1两轴。

讨论与结论翻译

讨论指出，本研究局限在于未单独评价各二肽，故相加或协同不可分；未来需单肽、亚组合与全重构对照。结论部分：本研究结果表明，按消化分级定量组成重构的干腌火腿二肽合成混合物，在化学 assay、离体与体内条件下保留生物学相关抗氧化活性。HDP与SPF比较显示，原分级活性可在一定范围由主要定量二肽定比组合重现，支持组成谱决定生物活性。两分级ABTS清除相近、DPPH有中等差别。细胞研究确认SPF安全曲线良好，显著降低Caco-2与EA.hy926内ROS；在C. elegans中二肽显著提升急慢性氧化应激存活、降低百草枯诱导ROS积累，并调控SOD-3与GST-4等关联DAF-16/FOXO与SKN-1/Nrf2通路的抗氧化应答基因。综上，消化肽分级的组成重构为探究复杂食品基质中定量肽贡献提供有用路径，支持西班牙干腌火腿源二肽作为调节氧化应激功能成分之潜力；但单肽相对作用及互作需深究，且需哺乳动物模型与人干预试验确证生物利用度、有效剂量与生理相关性。