使用对映选择性生物传感器进化不对称生物催化剂

《Nature Chemical Biology》：Using enantioselective biosensors to evolve asymmetric biocatalysts

　　

生物催化剂因其对映选择性而备受重视，但测量对映体过量所需的缓慢色谱分离过程制约了其发展。为克服这一局限性，研究人员进化了对映选择性转录因子，该因子能将酶催化的对映体浓度转换为可编程的基因表达输出，研究重点放在亚胺还原酶上。在此，利用大规模并行报告分析，研究人员测量了超过300,000个转录因子变体针对亚胺前体和手性胺产物的剂量-反应曲线。研究人员量化了由随机、位点饱和和嵌合诱变产生的变体的敏感性、选择性和动态范围，分离出了具有异常特异性的变体。通过进化eTF的高分辨率结构阐明了空间效应如何实现对映选择性，同时电荷相互作用区分了亚胺与胺。利用两种eTF，研究人员创建了一种超高通量手性筛选方法，以进化出一种具有反转对映选择性的亚胺还原酶。为了支持通用性和速度，研究人员设计了一种能在几周内生成TF的遗传电路。研究人员的方法能够快速测量不对称反应，支持化学制造领域的创新。

手性对于药物、农用化学品和香料具有巨大的生物学意义，然而不对称合成的传统方法仍充满挑战。过去十年中，由于工程酶具有极高的对映选择性，其应用迅速增长。限制对映选择性酶广泛使用的一个关键挑战是，将其工程化为适用催化剂需要耗费大量时间和精力，而这往往受到手性筛选速度的瓶颈制约。标准工作流程需要通过缓慢的色谱分离来筛选数千种酶，且通常需经过数轮迭代工程。尽管高通量质谱的最新进展缩短了某些应用的筛选时间，但由于对映体在质量上无法区分，这些改进无法用于定制对映选择性。

为解决手性筛选瓶颈，一种有前景的解决方案是采用对映选择的配体诱导型转录因子，将特定的细胞内化学浓度转换为可编程的基因表达输出。当与荧光蛋白偶联时，使用流式细胞荧光分选技术（FACS）等仪器可在几分钟内筛选数百万种生物催化剂。许多TF天然具有高度对映选择性，尽管天然TF识别的化学空间有限，但定向进化方法可以为其重塑针对治疗分子及其中间体的新配体特异性。尽管前景广阔，但TF的对映选择性从未被用于进化不对称生物催化剂，例如工业上用于安装立体中心备受青睐的转氨酶、酮还原酶或亚胺还原酶。在此背景下，研究人员开展了相关研究，旨在开发基于eTF的超高通量筛选平台，以加速不对称生物催化剂的工程化进程。该研究成果发表在《Nature Chemical Biology》上，为化学制造领域的酶工程创新提供了强大的测量工具。

研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：利用深度突变扫描结合大规模并行测序技术对超过30万个RamR变体进行全剂量-反应曲线的测量；使用X射线晶体学解析高选择性变体及其与配体复合物的高分辨率三维结构；通过流式细胞荧光分选技术（FACS）进行超高通量定向进化和筛选；使用手性液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）与生物传感器方法进行相关性比对验证；以及设计单质粒进化电路SELIS1以实现生物传感器的快速定向进化。

研究结果部分总结如下：

**生物传感器对映选择性的基因型-表型图谱**
研究人员以药物索利那新合成中间体——S-THIQ、R-THIQ和DHIQ为目标分子，在RamR TF scaffold上应用了随机诱变、位点饱和诱变和基因嵌合三种独立的文库设计策略。通过将TF反应与细胞生长偶联的选择电路，结合长读长测序映射条形码，研究人员生成了309,461个RamR变体针对三种配体的剂量-反应曲线。研究表明，测量三种配体的完整剂量-反应曲线对于量化文库变体间的选择性至关重要。

**三种生物传感器文库设计方法的比较**
为指导高效的文库设计，研究人员定量比较了三种常见策略产生的变体表型。研究发现，位点饱和文库中仅有1.3-2.1%的变体折叠诱导效应高于模板，而嵌合文库中这一比例显著较高（20.2-26.1%）。在选择性方面，大多数变体相比野生型蛋白失去了特异性，但嵌合文库产生的变体覆盖了所有三种配体的广泛选择性。在设定的折叠诱导、选择性和敏感性阈值下，即使按文库变体数量进行标准化，嵌合文库在每种配体上均产生了比例显著更高的高性能传感器，证明同源嵌合是强大的TF文库设计方法。

**高选择性生物传感器变体的表征**
研究人员从海量数据集中筛选出具有最高选择性和动态范围的传感器变体并进行表征。排名前六的变体（D2.1、D2.3、S2.3、S2.4、R2.1和R2.2）表现出极高的特异性，对其各自配体的半最大效应浓度（EC₅₀）比非同源配体低达56倍。晶体结构分析揭示了进化的对映选择性机制：电荷相互作用被证明可用于区分去质子化的亚胺与质子化的胺。在针对S-THIQ的变体中，C135E突变引入了带负电的谷氨酸，通过盐桥与质子化的胺相互作用；而D2.3变体中的C135R突变则通过带正电的精氨酸选择性识别中性的DHIQ基团。同时，配体结合口袋的空间位阻决定了S-THIQ和R-THIQ之间的严格对映选择性区分。

**IRED对映选择性的高通量筛选**
为展示eTF在不对称生物催化中的实用价值，研究人员构建了分别表达GFP和RFP的筛选质粒pScreen-S1.3和pScreen-R2.1，用于监测IRED将DHIQ还原为R-THIQ或S-THIQ的活性。通过与手性液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对比测量46种不同IRED的活性，发现对于15种高活性IRED，生物传感器测量的胞内产物与LC-MS测量的胞外产物之间存在对数相关性，且两种方法报告的对映体过量显示出极好的线性拟合。进一步，研究人员利用该生物传感器筛选了约32,000个IRED变体文库，经过FACS分选，成功鉴定出具有反转对映选择性的三重突变体IR35_C4（P130A, N177E, M184W），其R-对映体过量达到86%。

**针对其他手性胺的生物传感器快速进化**
为提高eTF生成方法的普适性和速度，研究人员开发了一种名为SELIS1的单质粒进化电路。利用该系统，仅用两周时间便成功进化出了对神经肌肉阻滞剂顺阿曲库铵前体——四氢帕帕微碱（THP）的对映体具有高度选择性的生物传感器RTHP2和STHP2。这两种变体均仅含四个突变，结构建模表明其通过π-π堆积与配体的苄基部分结合或通过氢键与配体胺结合来强制实现选择性。

讨论部分总结：
研究人员展示了一种利用eTF将不对称生物催化剂进化速度提升数个数量级的策略。通过将对映体特异性的反应产物转化为荧光信号，eTF能在30分钟内完成约8,000个IRED变体的筛选，而传统的色谱方法则需耗费11天和大量溶剂。研究结论指出，尽管eTF在检测灵敏度、跨化学结构的普适性以及化学选择性的快速定制方面仍面临一定挑战，但多维药调控因子（如RamR）能够识别多种化学基序，且只需极短的进化轨迹即可获得适用的eTF。该研究提供的大规模定量基因型-表型数据和单质粒进化平台为预测性设计目标生物传感器奠定了基础，未来结合机器学习模型将有望预测酶序列如何编码对映选择性，成为支持化学生物制造创新的强大工具。