《Nature Microbiology》：Within-patient gene transfer between transiently and chronically infecting bacteria causes extreme antibiotic resistance during lung infections
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感染期间出现的抗生素耐药性通常被认为是由病原体基因组中的突变引起的。研究人员研究了从囊性纤维化患者和非囊性纤维化支气管扩张患者中收集的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa）和无色杆菌属（Achromobacter sp.，Ac）细
感染期间出现的抗生素耐药性通常被认为是由病原体基因组中的突变引起的。研究人员研究了从囊性纤维化患者和非囊性纤维化支气管扩张患者中收集的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa）和无色杆菌属（Achromobacter sp.，Ac）细菌，这些细菌在开始托布霉素（tobramycin）治疗后，托布霉素耐药性突然增加了10,000倍。基因组分析表明，耐药性并非源于突变积累或菌株置换。相反，它的发生是因为质粒携带的耐药基因在患者肺部内被转移到了先前敏感的病原体。在一些病例中，研究人员识别了将质粒带入患者肺部的细菌，它们是能够在环境中生长的物种，如恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。最常转移的基因是一种aac(3)氨基糖苷类N-乙酰转移酶（aac(3)-IIId），此前未与临床耐药性相关联。进一步分析表明，该基因通过一个转座子从环境细菌中动员出来，并整合到可传播质粒中。这项工作表明，短暂感染与慢性感染细菌之间的基因转移可在人类感染期间导致抗生素耐药性的突然且大幅增加。
本研究发表于《Nature Microbiology》，聚焦于抗生素耐药性在感染期间突然出现的机制。背景方面，抗生素耐药性感染是全球重大健康问题，尤其在囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者中，慢性肺部感染常由敏感病原体起始，治疗过程中耐药性逐渐产生。传统观点认为，体内耐药性源自病原体基因突变积累，但突变通常导致渐进式耐药。然而，研究人员观察到多个CF和非CF支气管扩张患者中，在开始托布霉素（tobramycin, Tob）治疗后，托布霉素耐药性突然出现10,000倍增加，与突变积累模式不符，因此启动本研究以阐明机制。
研究人员对来自北美不同地点（西雅图、卡尔加里、匹兹堡、纽约）的17例患者（10例CF铜绿假单胞菌感染、1例非CF支气管扩张无色杆菌属感染）的纵向分离株进行分析。通过基因组测序、系统发育分析、质粒转移实验、表型微阵列及数据库搜索，发现极端耐药性并非由突变或菌株置换引起，而是由短暂感染细菌向慢性感染病原体在患者肺部内转移质粒所致。主要结论包括：识别了携带新基因aac(3)-IIId的转座子TnCF1，其来源于环境鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）；质粒高度稳定且适应度代价极小；TnCF1已在全球病原体中发现。该研究揭示了基因转移导致极端耐药性的新机制，对治疗策略产生重要影响。
关键技术方法方面，研究利用了三个样本队列：华盛顿大学Singh实验室、西雅图儿童医院和华盛顿大学的CF微生物学结果推进核心（MOAC）、卡尔加里成人CF诊所生物库（CACFB）。主要方法包括：Illumina和Oxford Nanopore测序进行全基因组及质粒完成；LoFreq进行变异检测；IQ-TREE构建系统发育树；接合和电转化进行质粒转移实验；ddPCR测定质粒拷贝数；Biolog表型微阵列（1344种条件）评估适应度代价；28天传代实验测定质粒稳定性；NCBI Pebblescout和BLAST搜索TnCF1在基因组和宏基因组数据库中的分布；同源性分析推断aac(3)-IIId起源。
研究结果分述如下：
1. Extreme resistance suddenly emerges in patients' lungs：通过测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），发现初始分离株Tob MIC低（0.125–8 μg ml
-1），高剂量吸入Tob后，MIC突然增加平均9,340倍，且耐药性持续多年。
2. Extreme resistance evolved in previously sensitive lineages：全基因组测序显示，患者1–8中敏感与eTobR分离株核苷酸差异极少（1–50个核苷酸），表明耐药性在同一谱系内进化，而非菌株置换。
3. eTobR isolates acquired plasmids carrying resistance genes：短读长和长读长测序发现eTobR分离株携带12–156 kb质粒，编码氨基糖苷类修饰酶基因；通过接合或电转化导入敏感菌，重现eTobR表型。
4. Sensitive isolates acquired plasmids inside patients' lungs：系统发育分析（排除质粒序列）在患者1、2、4、5中显示，含质粒分离株为早先无质粒分离株的后代，证实质粒在肺内获得。
5. Environmental bacteria carried plasmids to patients' lungs：通过PCR筛选共感染菌，在患者1、2、8中识别了携带相同质粒的物种（患者1：无色杆菌属和嗜麦芽窄食单胞菌；患者2和8：恶臭假单胞菌），这些物种仅短暂感染，且可在体外将质粒转移给敏感病原体。
6. eTobR plasmids can transmit between sibling bacteria：接合实验显示，eTobR质粒可在同一病原体菌株间传播，解释了质粒在多个亚系中的分布。
7. Plasmids are highly stable ex vivo as they are inside lungs：无Tob传代28天（约650代），>95%细菌保留质粒，归因于毒素-抗毒素系统（如parED）。
8. Plasmids impose minimal fitness costs：生长曲线和表型微阵列（1344种条件）显示，等基因菌株间无显著生长差异，质粒适应度代价极小。
9. Plasmids contain a previously undescribed Tn-borne resistance gene：质粒携带转座子TnCF1（含Tn5393骨架），包含新基因aac(3)-IIId，单拷贝可使Tob MIC增加1,000倍，对阿米卡星等有效。
10. Plasmid-borne TnCF1 is found in pathogens worldwide：数据库搜索（9.9百万基因组，含~43,000 Pa基因组）发现28个Pa和17个非Pa基因组携带TnCF1，遍布三大洲，多数为质粒类型。
11. TnCF1 may have originated from environmental Sphingomonas：同源性分析显示，鞘氨醇单胞菌染色体上aac(3)-IIId同源基因（83%身份）无移动元件，而另一鞘氨醇单胞菌质粒上ISKpn23（100%身份）与TnCF1的启动子相同，推测ISKpn23捕获基因并整合入Tn5393形成TnCF1。
讨论部分总结：四点证据支持病原体在肺内获得质粒导致eTobR（克隆相关性、质粒存在、系统发育
