TOPBP1激活ATR-ATRIP复制检查点激酶的结构机制

《Nature Structural & Molecular Biology》：Structural mechanism of TOPBP1 activating the ATR–ATRIP replication checkpoint kinase

　　

ATR蛋白激酶（ATR）通过在DNA复制过程中控制S期有序进行及应对复制应激所需的检查点，来维持基因组完整性。ATR与其必需伴侣ATRIP被TOPBP1和ETAA1蛋白激活，这两者控制ATR信号传导的不同分支。TOPBP1对于响应复制叉停滞而诱导S期检查点至关重要，而ETAA1则对于从未受干扰的S期及时进入有丝分裂是必需的。TOPBP1和ETAA1含有同源性有限的ATR激活结构域（AAD），但它们如何激活ATR尚未完全阐明。研究人员在此展示了结合TOPBP1 AAD的人源ATR-ATRIP复合物的3.0 ?冷冻电镜（cryo-EM）结构，表明TOPBP1通过诱导全局构象变化来变构重排约70 ?外激酶结构域中的活性位点残基，从而激活ATR。研究人员还展示了ATR-ATRIP-ETAA1 AAD复合物的3.3 ?结构，揭示了一种与TOPBP1不同的结合模式。研究数据表明，TOPBP1和ETAA1的不同结合模式导致了ATR-ATRIP激活的不同细胞背景和结果。

**论文解读：TOPBP1激活ATR-ATRIP复制检查点激酶的结构机制**

**研究背景与问题**

ATR蛋白激酶（ATR）是磷酸肌醇3激酶相关蛋白激酶（PIKK）家族成员，在DNA复制过程中通过控制检查点以维持基因组完整性，对S期有序进行和复制应激应答至关重要。ATR与其必需伴侣ATRIP形成复合物，并由TOPBP1和ETAA1两种蛋白激活，它们分别控制ATR信号的不同分支：TOPBP1负责响应复制叉停滞而诱导S期检查点，而ETAA1在未受干扰的S期提供基础ATR活性以防止过早进入有丝分裂及染色体不稳定。TOPBP1和ETAA1均含有ATR激活结构域（AAD），但二者序列同源性有限，且其激活ATR的分子机制此前尚未完全阐明。尽管已有低分辨率的人源ATR-ATRIP结构及酵母同源物Mec1-Ddc2结构，但关键激活机制仍未知。因此，研究人员旨在通过高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构解析，揭示TOPBP1和ETAA1如何通过不同结合模式激活ATR-ATRIP，并阐明其在不同细胞背景下的功能差异。该研究发表于《Nature Structural》。

**主要技术方法**

研究人员采用冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了人源ATR-ATRIP与TOPBP1 AAD（TOPBP1^AAD）及ETAA1 AAD（ETAA1^AAD）复合物的高分辨率结构（分别为3.0 ?和3.3 ?）。通过体外稳态动力学分析测定激活常数（k_cat和EC₅₀），利用GST pull-down实验评估结合能力，并借助定点突变验证关键残基功能。样本来源包括稳定转染的HEK293F细胞（表达ATR-ATRIP）和大肠杆菌BL21(DE3)菌株（表达TOPBP1及ETAA1片段）。

**研究结果**

**1. Cryo-EM analysis of ATR–ATRIP–TOPBP1^AAD**
研究人员首先比较了TOPBP1^AAD与全长TOPBP1的活性，发现二者均使ATR-ATRIP的催化常数（k_cat）提升约100倍，但TOPBP1^AAD的半最大效应浓度（EC₅₀）高出5倍，可能因其缺乏AAD外的二聚化结构域。冷冻电镜分析显示，apo-ATR-ATRIP形成环状同源二聚体，通过ATRIP-ATRIP和FAT-FAT两个界面连接，且M-heat结构域存在铰链旋转导致不对称性。在TOPBP1^AAD结合的数据中，三维分类揭示了一个零倾斜的C2对称类，其中激酶结构域（KD）的N叶和C叶发生旋转，排列方式与活性mTOR和DNA-PKcs相似，表明该构象为激活态。通过C2对称性扩展和部分信号减法，获得了3.0 ?分辨率的复合图。

**2. TOPBP1^AAD binding to ATR–ATRIP**
TOPBP1^AAD以三个不连续片段结合ATR-ATRIP：tα1螺旋结合N-heat的保守疏水沟，tα2螺旋结合N-heat与ATRIP之间的裂隙，而tβ1α3片段（含β-strand和α-helix）结合N-heat、M-heat1和FAT结构域的交界处。tβ1α3的结合位点在apo结构中不预先形成，其结合促使FAT结构域旋转约27°，进而导致全局构象变化。

**3. TOPBP1 allosterically activates ATR–ATRIP**
tβ1α3结合使FAT结构域发生协同性构象变化，通过铰链区域传递至激酶结构域，使N叶和C叶相对旋转，重新对齐活性位点残基（如Lys2327、Asn2480和Asp2494），形成催化活性构象。该过程在双亚基中协同发生，通过ATRIP-ATRIP和FAT-FAT二聚化界面传递运动。突变分析证实，tα1和tα2片段主要参与招募，而tβ1α3（尤其是Trp1145）是驱动构象变化的关键，其突变（如W1145R）彻底消除激活但结合力几乎不受影响。

**4. Cryo-EM structure of ATR–ATRIP bound to ETAA1^AAD**
ETAA1^AAD激活能力远低于TOPBP1^AAD（仅约5倍提升），但其结合亲和力相当。磷酸化模拟突变S95D/S111D可将激活水平提升至TOPBP1^AAD的约70%。冷冻电镜结构显示，ETAA1^AAD以四个不连续片段结合ATR，包括eβ1、eα1、eα2和eα3，但链方向与TOPBP1相反。eβ1与FAT结合，但缺乏与N-heat和M-heat1的耦合，因此无法诱导FAT-KD的激活构象。eα1和eα2结合于独特位点，使M-heat铰链呈现闭合样构象，但未达到激活态。在S95D/S111D突变体中，Asp111稳定了eβ1末端的α-螺旋延伸，与N-heat产生额外接触，但仍缺乏与M-heat的相互作用，因而未捕获到激活构象。竞争实验表明，未磷酸化的ETAA1^AAD可抑制TOPBP1介导的ATR激活，提示其可能作为拮抗剂。

**讨论与结论**

研究人员表示，ATR-ATRIP-TOPBP1^AAD结构揭示了TOPBP1通过三个不连续片段结合ATR，其中tα1和tα2负责招募，而tβ1α3的结合自由能用于诱导FAT结构域的构象变化，进而使激酶结构域的两个叶相对旋转，对齐活性位点。该激活机制与mTOR和DNA-PKcs保守，不同之处在于触发点位于FAT结构域中部，由M-heat（ATR）或N-heat（mTOR和DNA-PKcs）变构拉动。FAT结构域被提出为自抑制夹，保持N叶和C叶错位，而激活突变可解除此抑制。与酵母Mec1-F2244L突变体的比较表明，后者激活态与ATR的活性构象不同。早期研究提出的ATRIP二聚体界面和激酶结构域上的PIKK调节结构域（PRD）在结构上未观察到TOPBP1^AAD结合，PRD段在ATR中类似mTOR，与激活无关。研究结论：ATR-ATRIP-TOPBP1^AAD复合物处于非活性与活性状态的平衡中，非活性TOPBP1结合态具有中间界面，向更广泛界面的转变触发FAT构象变化，使激酶结构域进入活性构象。对于未磷酸化的ETAA1^AAD，平衡明显偏向非活性态，因其结构基序排列不同。S95D/S111D磷酸化模拟显著增加激活潜力，主要通过eβ1末端的无序-有序转变实现。TOPBP1和ETAA1的不同激活能力和竞争性结合表明，它们通过不同结合模式调节ATR活性以适应不同信号背景和结果。