一种新型小分子髓鞘再生疗法用于多发性硬化症

《npj Drug Discovery》：A novel small molecule remyelination therapy for multiple sclerosis

　　

研究人员对20,000个偏向中枢神经系统（CNS）的小分子进行了表型筛选，检测其刺激小鼠少突胶质前体细胞（OPCs）分化为少突胶质细胞的能力。研究人员鉴定出一个先导化合物（CN045），其在OPC分化实验中的EC₅₀为40 nM，且具有利于修饰的化学骨架。在OPC分化实验中，CN045表现出比已知的OPC分化化合物三碘甲状腺原氨酸（T3）更高的效力。CN045促进了小鼠和人类OPCs对工程化纳米纤维的髓鞘样包裹，并在cuprizone/rapamycin诱导的脱髓鞘后，显著增加了小鼠脑白质和灰质区域的髓鞘再生。在药代动力学方面，CN045具有中枢神经系统穿透性且低细胞毒性。CN045在体内半衰期短，但其化学骨架有利于结构修饰，可改善其代谢特性。总之，这些结果表明CN045是增强多发性硬化症患者OPC分化和髓鞘再生的有吸引力的先导候选化合物。

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的炎症介导性脱髓鞘疾病，是年轻成年人非创伤性神经功能障碍的主要原因。目前批准的20多种疗法主要抑制炎症介导的脱髓鞘，但无法阻止不可逆的残疾进展。脱髓鞘轴突因缺乏髓鞘营养支持而最终退化，导致继发性进行性（SPMS）阶段的残疾。髓鞘再生依赖于少突胶质前体细胞（OPCs）分化为新的少突胶质细胞，但MS病变中这一过程最终失败。因此，开发促进OPC分化的髓鞘再生疗法是神经保护的关键策略。研究人员采用表型筛选方法，从20,000个CNS偏向小分子文库（ChemBridge Library）中鉴定出先导化合物CN045。该化合物在体外OPC分化实验中EC₅₀为40 nM，效力高于阳性对照三碘甲状腺原氨酸（T3）。CN045能促进小鼠和人类OPCs对工程化纳米纤维的髓鞘样包裹，并在cuprizone/rapamycin（cup/rap）诱导的慢性脱髓鞘小鼠模型中显著增强脑白质（胼胝体）和灰质（海马、大脑皮层）的髓鞘再生。药代动力学显示CN045具有CNS穿透性、低细胞毒性，但体内半衰期短（2.7小时），其化学骨架有利于结构修饰以改善代谢性质。研究还初步探索了CN045的结构-活性关系（SAR），发现碱性氮原子对OPC分化效力至关重要，而连接基团和芳基基团可进行优化。该研究发表在《npj Drug Discovery》上，表明CN045是治疗MS髓鞘再生的有吸引力的先导化合物，为后续优化提供了基础。

主要关键技术方法：研究人员利用PLP-EGFP转基因小鼠胚胎皮层神经球制备原代小鼠OPCs，建立基于荧光检测的高通量表型筛选平台（Z'因子0.58-0.69）。从ChemBridge CNS偏向小分子文库（20,000个化合物）中筛选，初筛浓度10 μM，以T3为阳性对照，阈值设为T3效力的50%。复筛采用半对数稀释（0.1-10 μM），计算EC₅₀。体外验证使用免疫纯化的A2B5+小鼠OPCs和3D工程化纳米纤维共培养，检测髓鞘样包裹；人类OPCs来自3例手术切除的脑皮层组织（年龄2、13、35岁，1男2女）。体内采用cup/rap诱导的慢性脱髓鞘模型（12周0.3% cuprizone饲料+每日腹腔注射10 mg/kg rapamycin），随后6周每日腹腔注射CN045（10 mg/kg）或溶剂，通过PPD染色（胼胝体）和PLP免疫组化（海马、皮层）量化髓鞘再生。药代动力学评估包括肝微粒体稳定性、P450抑制及体内半衰期测定。

研究结果：
1. 建立基于细胞的高通量表型OPC分化实验：研究人员利用PLP-EGFP转基因小鼠的OPCs，建立无需免疫染色的高通量筛选平台。Z'因子在0.58-0.69之间，表明实验质量可靠。T3能显著增加PLP-EGFP+少突胶质细胞数量。
2. 20,000个小分子的表型筛选：初筛在10 μM浓度下鉴定出390个阳性化合物（效力>T3的50%），复筛后57个化合物在1 μM浓度下效力>T3的50%，最终43个化合物EC₅₀低于1 μM，18个低于0.2 μM。其中三个EC₅₀最低（0.030 μM）的化合物为苄基哌嗪类似物，但存在知识产权、脱靶效应和毒性问题。CN045（EC₅₀=0.040 μM）被选为先导化合物。
3. CN045在体外增加小鼠OPC分化：CN045处理5天后显著增加PLP-EGFP+少突胶质细胞数量，且细胞呈现更复杂的“睡莲叶”形态，表达髓鞘蛋白PLP和MBP。与T3相比，CN045效力更高。
4. CN045促进工程化纳米纤维的髓鞘样包裹：在3D纳米纤维上培养的免疫纯化A2B5+小鼠OPCs中，CN045处理14天后显著增加与纳米纤维关联的少突胶质细胞数量及髓鞘样包裹总长度，效果优于T3，且MBP阳性突起包裹纳米纤维。
5. CN045促进人类OPC分化：从3例手术切除的人脑皮层组织中纯化的A2B5+ OPCs，经CN045处理14天后，显著增加O4+少突胶质细胞百分比和MBP阳性纳米纤维包裹长度。
6. CN045在cuprizone/rapamycin脱髓鞘小鼠模型中增强髓鞘再生：在cup/rap处理12周（导致胼胝体、海马、皮层显著脱髓鞘）后，6周CN045治疗（10 mg/kg/d i.p.）显著增加上述区域的髓鞘再生，表现为胼胝体PPD+髓鞘轴突数量增加，海马和皮层PLP免疫阳性面积增加。
7. CN045的初步结构-活性关系（SAR）：对20个CN045商业类似物进行OPC分化实验，揭示碱性氮原子对效力重要，连接基团和芳基基团可耐受多种修饰，为优化药代性质提供方向。

讨论部分总结了研究意义：CN045通过表型筛选发现，相比靶点筛选具有优势。其促进OPC分化的效力高于T3，且在cup/rap慢性脱髓鞘模型中证明有效。CNS穿透性好，低毒性，但半衰期短需结构优化。研究结论部分（Discussion末尾）可翻译为：研究人员描述了一种小分子方法用于鉴定新型髓鞘再生疗法。该方法展示了表型筛选的优势，因为CN045的知识产权路径似乎是开放的。研究人员目前正在追踪CN045的靶点，因为明确的“go/no-go”研究结果令人鼓舞。已经进行了额外的先导优化研究，产生了具有与CN045相当OPC分化效力但改善的理化性质和ADME性质的新类似物，这些数据将是未来发表的一部分。