SYCP2将HORMAD2招募至染色体轴以进行减数分裂中未联会染色质沉默和联会监测

《Nature Communications》：SYCP2 recruits HORMAD2 to chromosome axes for unsynapsed chromatin silencing and synapsis surveillance in meiosis

　　

在减数分裂过程中，同源染色体的精确分离需要准确的同源重组和联会。这些过程在哺乳动物中由包含减数分裂HORMA结构域蛋白（HORMAD1和HORMAD2）的检查点监控，它们结合未联会的染色体轴，并独立于DNA双链断裂（DSBs）促进DNA损伤应答激酶ATR的激活。然而，体内HORMAD1和HORMAD2的轴向招募机制及其与检查点信号的相关性仍不清楚，尽管染色体轴组分SYCP2被认为包含一个候选的HORMAD结合闭合基序（CM）。研究人员发现，删除SYCP2的CM会破坏SYCP2-HORMAD2复合物，并选择性地阻止HORMAD2的轴结合，而不影响轴组装、重组或轴向HORMAD1的招募。因此，未联会轴上的ATR积累和信号减弱，前期检查点功能失常，表现为联会能力正常的精母细胞异常消除和未联会卵母细胞的持续存在，这反映了检查点机制的性别特异性特征。SYCP2-CM缺陷小鼠和HORMAD2缺失小鼠的表型不可区分，确立了HORMAD2轴招募在联会监测中的必要性。研究人员提出，轴向招募产生一个HORMAD2支架，该支架驱动独立于DSBs的聚类介导的ATR网络激活，从而将哺乳动物减数分裂中的染色体轴结构与联会质量控制联系起来。

**论文解读：SYCP2闭合基序介导的HORMAD2轴招募在减数分裂联会监测中的关键作用**

**研究背景与问题**

在减数分裂前期，同源染色体必须正确配对、联会并通过重组形成交叉，以确保染色体有序分离。这些过程受到严格的质量控制检查点监控，该检查点通过消除存在持续未联会或未修复DNA双链断裂（DSBs）的配子细胞来保护基因组完整性。在哺乳动物中，DNA损伤应答（DDR）激酶ATR及其辅助因子是这一检查点的核心。ATR在未联会区域被高度激活，驱动未联会染色质沉默（MSUC），并协同DSBs来源的经典ATR信号通路，共同监测联会和重组。

未联会染色体存在两个关键传感器：减数分裂HORMA结构域蛋白HORMAD1和HORMAD2，它们优先结合未联会染色体轴。HORMAD1和HORMAD2协同作用，促进BRCA1和TOPBP1的轴结合，进而导致ATR在未联会轴上的积累和激活。这种轴向ATR信号随后通过正反馈回路扩散至染色质环，驱动MSUC。然而，HORMAD1和HORMAD2如何被招募至染色体轴，以及轴向定位是否对其功能至关重要，此前尚不清楚。尽管轴蛋白SYCP2被预测含有一个能与HORMAD1/2相互作用的闭合基序（CM），但该CM在体内的作用从未被报道。因此，明确HORMAD2的轴向招募机制及其与检查点信号的关系是本研究的核心问题。

**研究内容与结论**

本研究通过CRISPR/Cas9技术在小鼠中删除Sycp2基因第16号外显子（编码预测的CM），建立Sycp2^e16/e16突变小鼠模型，系统分析了SYCP2 CM在HORMAD1和HORMAD2轴招募以及减数分裂检查点功能中的作用。研究人员发现，该CM的缺失特异性地破坏了SYCP2与HORMAD2的复合物形成，导致HORMAD2无法结合到染色体轴，而HORMAD1的轴结合、轴组装和重组均未受影响。Sycp2^e16/e16小鼠的表型与Hormad2^-/-小鼠完全一致，包括雄性不育、精母细胞在中期粗线期凋亡、以及卵母细胞中联会检查点缺陷。这些结果确立了SYCP2 CM是HORMAD2轴招募的主要锚点，并且轴向结合的HORMAD2是驱动ATR激活和联会质量控制所必需的。该研究揭示了通过闭合基序介导的HORMA蛋白招募到其监测结构上的保守调控逻辑，这一机制与纺锤体组装检查点相似，但应用于减数分裂联会监测。论文发表在《Nature Communications》。

**关键技术方法**

研究人员主要采用了以下技术方法：1. CRISPR/Cas9基因编辑技术，在小鼠中构建Sycp2^e16/e16突变品系（C57BL/6J背景）；2. 免疫荧光显微镜分析，对精母细胞和卵母细胞进行核表面铺展和性腺切片染色，评估轴形态、联会复合体（SC）形成、重组焦点（RAD51、DMC1、RPA）和检查点蛋白（ATR、BRCA1、γH2AX）定位；3. 免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白免疫印迹，检测SYCP2与HORMAD1/2的体内相互作用及蛋白质亚细胞分布；4. 单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析睾丸细胞转录组，评估性染色体失活（MSCI）效率；5. 定量逆转录PCR（RT-qPCR），验证Zfy1和Zfy2表达水平；6. 酵母双杂交（Y2H）实验，验证HORMAD1与HORMAD2的相互作用；7. AlphaFold 3蛋白质结构预测，辅助分析CM结合模式。

**研究结果**

**1. 预测的SYCP2 CM是雄性生育所必需的，但不影响轴和SC形成**
删除Sycp2第16号外显子后，小鼠轴组装和SC形成正常，但雄性完全不育，睾丸重量显著降低，精母细胞在中期粗线期（第IV期）发生凋亡，表明SYCP2 CM对雄性生育至关重要，但并非轴或SC结构所必需。

**2. SYCP2 CM对HORMAD2向染色体轴的招募至关重要**
免疫荧光和Co-IP实验表明，Sycp2^e16/e16配子细胞中HORMAD2完全无法结合染色体轴，而HORMAD1的轴结合正常。SYCP2免疫沉淀显示，突变体中SYCP2仅与HORMAD1结合，而不与HORMAD2结合。HORMAD1与HORMAD2的体内相互作用也依赖于SYCP2 CM。

**3. SYCP2 CM缺失不显著改变重组动力学**
通过定量分析重组焦点（RAD51、DMC1、RPA），发现Sycp2^e16/e16与Hormad2^-/-及野生型小鼠之间重组动力学相似，表明HORMAD2轴缺失对DSB形成和修复仅有轻微影响。

**4. SYCP2 CM缺失不导致主要联会缺陷**
SC形成评估显示，Sycp2^e16/e16和Hormad2^-/-精母细胞中仅少数细胞存在不完全联会（约17%和14%），且主要为XY染色体假常染色体区域（PAR）的未联会。此外，两种突变体均出现性染色体与常染色体之间的异常（非法）相互作用频率升高（62%和69%），提示MSCI受损。

**5. SYCP2 CM是性小体形成和MSCI所必需的**
免疫荧光分析显示，Sycp2^e16/e16精母细胞中γH2AX富集域缩小且不连续，ATR和BRCA1在性染色体轴上的积累显著减少，性染色体压缩受损。RNA Pol II在性染色体上未被排除，表明MSCI缺陷。scRNA-seq进一步证实，Sycp2^e16/e16和Hormad2^-/-精母细胞中X/Y染色体的转录抑制效率显著低于野生型，Zfy1和Zfy2表达上调。

**6. SYCP2 CM对卵母细胞中的联会检查点至关重要**
通过构建Sycp2^e16/e16与Spo11^-/-、Iho1^-/-或Dmc1^-/-的双突变体，发现突变体联会检查点缺陷表现为：Spo11^-/-和Iho1^-/-背景下的卵母细胞数量恢复至接近野生型水平，而Dmc1^-/-背景下卵母细胞仍被有效消除。在Spo11^-/-卵母细胞中，Sycp2^e16/e16导致BRCA1和γH2AX在未联会轴上的积累完全消失，伪性小体（PSB）不形成。

**总结讨论与结论**

研究讨论指出，SYCP2 CM编码的闭合基序是HORMAD2向染色体轴招募的主要锚点，而HORMAD1可能通过其他未知机制独立于该CM结合轴。尽管HORMAD1在突变体中仍能结合轴，但无法招募HORMAD2，也无法有效替代HORMAD2的功能，表明轴向HORMAD2是驱动ATR信号放大的关键。研究人员提出，轴向HORMAD2通过形成支架，促进BRCA1、TOPBP1和ATR的聚类，从而在无DSBs情况下激活ATR；而DSBs附近的ATR激活则可能通过正反馈进一步增强HORMAD2的招募和信号传递。这一机制确保了未联会染色质的沉默和联会质量控制的实现。

研究结论翻译如下：
“总之，我们的数据表明，SYCP2 CM介导的HORMAD2向未联会轴的招募能够实现高效的ATR激活。这一机制在ATR激活网络的正反馈回路中得到加强，维持了高水平的染色质结合ATR活性，从而促进未联会染色质的沉默，并构成联会监测和质量控制的基础，为哺乳动物减数分裂中防止非整倍体提供了关键保障。更广泛地说，我们的发现表明，通过闭合基序将HORMA结构域蛋白招募到它们所监测的结构上，是一种在纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint）和减数分裂联会检查点（meiotic synapsis checkpoint）之间共享的保守调控逻辑，尽管它们具有不同的细胞环境和分子靶标。”