综述：组合式原位癌症疫苗：解锁广泛且增强的抗肿瘤反应

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Combinatorial in situ cancer vaccines: unlocking broad and enhanced antitumor responses

　　

原位癌症疫苗接种，也称为瘤内免疫治疗，通过利用肿瘤本身作为抗原来源，将肿瘤微环境转化为内源性疫苗平台。与传统肿瘤相关抗原（TAA）或个性化新抗原疫苗需要预定义靶点和复杂制造不同，原位癌症疫苗接种呈现肿瘤的完整抗原谱，包括肿瘤相关抗原（TAA）、新抗原、翻译后修饰表位、隐蔽肽以及在其天然背景下的病毒抗原。这种广泛的抗原暴露引发强大的多克隆细胞毒性T细胞反应，促进表位扩散，并减少由肿瘤异质性驱动的免疫逃逸。该方法治疗功效源于多种免疫机制的协调激活。程序性细胞死亡途径，包括免疫原性凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡，释放肿瘤抗原和危险相关分子模式（DAMP），促进树突状细胞活化、高效交叉呈递，以及持久效应和记忆T细胞的启动。强效佐剂和先进递送平台的整合增强了先天-适应性互作，并有助于重塑免疫抑制性肿瘤微环境。尽管有这些优势，但由于免疫原性细胞死亡诱导不一致、治疗药物瘤内滞留不理想以及T细胞浸润障碍，临床转化仍受限。纳米医学驱动的递送系统、微环境调节和组合策略（特别是与免疫检查点阻断联合）的最新进展正在克服这些挑战。总体而言，这些创新将原位癌症疫苗接种定位为一种患者定制、广泛适用的免疫疗法，能够引发持久且全身性的抗肿瘤免疫。

引言
原位癌症疫苗接种，也称为瘤内免疫治疗（ITI），已成为一种有前景的免疫治疗策略，将肿瘤微环境转化为个性化疫苗工厂。与传统癌症疫苗（通常涉及外源性递送肿瘤相关抗原（TAA）或新抗原与免疫佐剂组合）不同，原位疫苗接种直接在肿瘤部位引发免疫反应。这通常通过瘤内注射免疫佐剂（如Toll样受体（TLR）激动剂、促炎细胞因子或溶瘤病毒）实现，这些佐剂促进局部抗原释放、摄取和抗原呈递细胞（APC）的交叉呈递。原位疫苗接种的一个决定性优势在于其能够利用肿瘤的完整抗原谱，包括共享的TAA和由肿瘤特异性突变产生的独特新抗原。这种抗原多样性使得产生广泛的多克隆细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应成为可能，降低抗原丢失变异体的风险，并增强靶向异质性肿瘤亚克隆的能力。此外，原位癌症疫苗解决了传统癌症疫苗的主要局限性，包括可能导致免疫逃逸的肿瘤异质性和抗原丢失变异体。传统癌症疫苗（如肽基或树突状细胞疫苗）旨在针对预定义抗原引发全身性免疫，但常受限于免疫原性不足和抗原加工可变性。相比之下，原位疫苗接种触发强烈的局部炎症反应，不仅启动CTL，还促进表位扩散，从而增强全身性抗肿瘤免疫反应的广度和持久性。

近期临床研究强调了原位疫苗接种的治疗潜力。在一项I/II期试验中，27%的惰性淋巴瘤患者在接受TLR9激动剂PF-3512676联合低剂量放疗的瘤内注射后，在远处未注射肿瘤部位获得了客观临床反应，包括一例完全缓解和三例部分缓解。值得注意的是，有多项反应持久，持续时间长于既往治疗，并与肿瘤反应性记忆CD8⁺ T细胞的诱导相关，支持了这种原位疫苗接种策略的全身性疗效。最近，溶瘤病毒talimogene laherparepvec（T-VEC）通过诱导免疫原性细胞死亡（ICD）和局部免疫激活，在黑色素瘤中显示出临床获益，特别是与免疫检查点抑制剂联用时。总体而言，这些发现为将原位疫苗接种方法与其他免疫治疗方式整合以增强临床疗效提供了强有力的理论依据。为补充和扩展这一原则，研究人员开发了额外的免疫策略，以捕获广泛的肿瘤抗原，同时解决新抗原个性化疫苗的局限性。此外，它们与免疫佐剂或免疫检查点抑制剂的组合可能协同增强T细胞启动并提高治疗效果。

传统癌症疫苗依赖于识别、选择和离体制备有限数量的肿瘤特异性新抗原，并搭配免疫佐剂（例如肽、蛋白质、RNA、DNA）。这些策略虽然针对选定靶点有效，但受限于技术复杂性、长制造周期和狭窄的抗原覆盖范围，使其容易受到抗原丢失和肿瘤演化的影响。（图1）个性化癌症疫苗基于通过基因组测序鉴定的患者特异性肿瘤新抗原开发。这些预选抗原被编码入mRNA或肽疫苗中，并递送以引发高度特异性的CD8⁺ T细胞反应。尽管该策略能够精准靶向肿瘤突变，且脱靶效应最小，但其受限于高生产成本、长制造时间以及自发性抗原扩散能力降低。该图使用BioRender生成（https://biorender.com）。

个性化癌症疫苗随时间推移诱导T细胞反应，其特征为从头T细胞激活，随后进行聚焦性克隆扩增。由于疫苗抗原多样性有限，抗原扩散受限，导致免疫反应较窄，招募靶向次级肿瘤抗原的新T细胞克隆减少。相比之下，原位癌症疫苗通过利用肿瘤本身作为抗原和免疫激活的来源，提供了一种根本不同的方法。它涉及直接瘤内注射免疫刺激性免疫佐剂，如模式识别受体（PRR）激动剂（包括Toll样受体（TLR）激动剂、STING激动剂、细胞因子或溶瘤病毒），单独使用或与免疫原性细胞死亡（ICD）诱导剂（包括化疗、放疗、光动力疗法（PDT）或纳米材料平台）联用，从而实现快速、局部的免疫激活（图2）。原位癌症疫苗的机制与免疫学。原位疫苗接种涉及瘤内施用ICD诱导剂（如化疗、放疗或光动力疗法）联合免疫佐剂。该策略促进肿瘤完整抗原谱的释放。这些抗原与DAMP和佐剂一起，通过PRR被APC识别，导致树突状细胞成熟，并通过信号1（MHC:TCR）、信号2（CD28:B7）和信号3（细胞因子）实现强效T细胞启动。因此，原位癌症疫苗诱导广泛的多克隆T细胞反应，包括预先存在的T细胞增强和针对患者异质性肿瘤克隆完整谱系的各种T细胞克隆的从头激活。此外，在肿瘤杀伤后，抗原释放的次级波驱动表位扩散以及额外T细胞群体的激活和招募，强化免疫反应。该图使用BioRender生成（https://biorender.com）。

这种组合策略促进肿瘤细胞死亡以释放内源性癌症抗原，引起局部炎症和强效免疫激活，通过增强抗原加工和呈递来实现APC激活以启动T细胞。原位癌症疫苗的一个关键优势在于其能够利用肿瘤的完整抗原谱，包括共享的TAA、由体细胞突变产生的新抗原、翻译后修饰表位、病毒抗原（例如人乳头瘤病毒（HPV）、Epstein-Barr病毒（EBV））和癌胚蛋白。这种广度消除了抗原选择的需求，并能够实现快速、患者定制化的免疫反应。在治疗诱导的应激或破坏后，肿瘤细胞释放DAMP，如钙网蛋白（CRT）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP），这些被APC（尤其是树突状细胞（DC））通过PRR识别，导致抗原摄取、成熟和向T细胞的交叉呈递。该过程启动T细胞激活的三个经典信号。这些信号共同导致CD8⁺ CTL和CD4⁺辅助性T细胞的激活和克隆扩增，以及长寿记忆T细胞亚群的生成。

值得注意的是，由于在原位癌症疫苗接种过程中呈现了肿瘤的全部抗原景观，该策略引发能够识别和消除多种肿瘤亚克隆的多克隆T细胞反应。重复的抗原释放支持表位扩散，动态扩大激活T细胞克隆的库，并增强针对异质性肿瘤克隆的免疫监视。该过程增强全身性抗肿瘤免疫力并限制免疫逃逸。具体而言，当肿瘤细胞经历ICD时，它们释放先前未被识别的肿瘤相关或新抗原表位。这些抗原随后被DC捕获、加工，并通过MHC分子呈递给初始T细胞，导致针对不同肿瘤表位的新T细胞克隆激活。抗原特异性T细胞群体的这种渐进多样化通过识别异质性肿瘤克隆（包括那些缺乏初始靶向抗原的克隆）来增强免疫监视。在治疗上，表位扩散的诱导增强了抗肿瘤反应的广度和适应性，有助于减轻由抗原丢失或克隆演化驱动的肿瘤免疫逃逸风险。结果不仅是强大的初级反应，而且是持久的全身性免疫，支持对肿瘤复发和转移扩散的长期控制。然而，这一过程仍不完整，因为持续的抗原异质性和T细胞耗竭仍可能导致免疫逃逸。因此，将原位癌症疫苗与免疫检查点阻断相结合是克服这些局限性所必需的。这些预选新抗原由APC呈递，以产生针对特定肿瘤克隆的聚焦性多克隆T细胞反应。个性化疫苗提供每个表位的高精度和效力，但诱导延迟且更窄的免疫反应，表位扩散有限，且易受抗原丢失变异体的影响。在初始阶段，强大的T细胞反应选择性地消除表达靶向新抗原的肿瘤细胞，产生塑造肿瘤演化的免疫压力。这种选择性清除可能导致抗原丢失变异体或未靶向克隆的短暂扩增。

尽管如此，个性化新抗原疫苗接种建立的炎症环境促进来自垂死癌细胞的额外肿瘤抗原释放，这些抗原随后被APC摄取和呈递。该过程招募新T细胞克隆，并逐步拓宽整体免疫库。尽管有这种潜力，但个性化疫苗接种中抗原扩散的广度和动力学本质上受限于初始狭窄的抗原库以及连续几轮肿瘤清除和抗原加工所需的时间。因此，免疫反应可能深入且持久，但与原位癌症疫苗接种策略相比，对高度异质性或快速演化的肿瘤的适应性较差。相比之下，原位癌症疫苗从一开始就利用整个肿瘤抗原库，实现快速、广泛且动态扩展的多克隆T细胞反应，而个性化疫苗则针对选定的新抗原提供延迟但精准靶向的反应。两种策略尽管动力学和广度不同，但最终都支持持久记忆T细胞群体的生成，但原位癌症疫苗提供更大的广度和对肿瘤异质性的适应性，而个性化疫苗提供增强的精度和效力。这些互补优势凸显了将原位癌症疫苗与个性化疫苗整合以实现更具弹性的抗肿瘤免疫的潜力。

原位疫苗接种的关键要素
免疫原性细胞死亡诱导
免疫原性细胞死亡（ICD）是原位疫苗接种启动肿瘤免疫的几种机制之一。ICD是一种受调控的细胞死亡形式，通过释放或暴露内源性免疫刺激分子（如钙网蛋白（CRT）、ATP和HMGB1）来引发适应性免疫反应。与免疫学上沉默的耐受性细胞死亡不同，ICD将垂死的肿瘤细胞转化为肿瘤相关抗原和免疫激活信号的强效来源。这些信号促进DC对抗原的摄取，促进DC成熟，并增强T细胞启动，有效将肿瘤转化为内源性疫苗。

凋亡性细胞死亡是最充分表征的受调控细胞死亡形式，通常是非炎症性和耐受性的。它涉及膜起泡、染色质浓缩和caspase激活，最终导致凋亡小体的快速吞噬清除，而不触发免疫激活。Ronchetti等人（1999）的开创性研究首次证明凋亡肿瘤细胞可以引发免疫反应，为ICD概念提供了早期基础。虽然凋亡在维持组织稳态中起关键作用，但其免疫学沉默可能限制抗肿瘤免疫的激活。此外，肿瘤细胞常通过上调抗凋亡蛋白（如B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、存活素）或促凋亡调控因子（如p53）突变来发展出对凋亡的抵抗性，使其能够逃避治疗诱导的细胞死亡和免疫识别。

相比之下，非凋亡形式的受调控细胞死亡，包括坏死性凋亡、焦亡和铁死亡，通常由于能够破坏质膜完整性而导致DAMP释放，因此具有高度免疫原性。这些裂解性细胞死亡形式不仅规避了肿瘤中常见的凋亡抵抗机制，还促进强大的免疫激活，使其成为增强癌症治疗中ICD的有吸引力的策略。

释放的DAMP与先天免疫细胞中的PRR（如TLR、NOD样受体（NLR）和STING（干扰素基因刺激因子）通路）结合。这导致I型干扰素的产生和促炎信号级联的激活，驱动DC成熟和抗原呈递。因此，非凋亡性ICD同时绕过凋亡抵抗并协调先天性和适应性免疫反应，从而增强T细胞启动，并在癌症免疫治疗中促进有效的肿瘤清除和长期免疫监视（图3）。原位癌症疫苗接种增强的ICD促进强大的DC激活和适应性免疫。原位癌症疫苗接种利用ICD诱导剂和免疫佐剂启动ICD，包括焦亡、坏死性凋亡和铁死亡，促进DAMP和广泛肿瘤抗原的释放。这些DAMP与DC上的先天免疫受体（包括CD91、P2X7和TLR4）结合，促进其成熟和抗原呈递能力。同时，疫苗制剂递送的免疫佐剂激活额外的PRR，如TLR7/8或STING，进一步放大DC激活和细胞因子释放。有效的DC激活驱动T细胞启动，促进多克隆CD8⁺ T细胞反应和记忆形成。每种ICD表现出不同的免疫学效应：焦亡促进CD8⁺ T细胞启动和Th1极化；坏死性凋亡增强交叉启动和记忆CTL生成；铁死亡诱导抗原扩散，有助于靶向异质性肿瘤。该图使用BioRender生成（https://biorender.com）。

这些DAMP不仅作为免疫刺激信号，还确保肿瘤抗原的有效加工和呈递，使ICD成为抗肿瘤免疫的强大驱动力和原位疫苗接种疗效的核心组成部分（表1）。表1 原位癌症疫苗接种中的关键DAMP和PAMP及其免疫功能。因此，理解不同ICD途径如何促进免疫反应的诱导，可为有效利用垂死肿瘤细胞增强原位癌症疫苗接种治疗策略提供机制基础。每种程序性细胞死亡（PCD）模式引发独特的DAMP、细胞因子和肿瘤衍生抗原库，这些共同影响DC激活、抗原交叉呈递和T细胞启动（图4）。程序性细胞死亡途径及其在诱导ICD以增强原位疫苗接种中的作用。该图描绘了四种主要形式的受调控细胞死亡——凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡，它们均可诱导ICD，其特征是DAMP的释放。虽然凋亡在正常情况下通常被认为是弱免疫原性的，但在特定应激条件下（如内质网应激或化疗诱导的损伤），它可以获得ICD样特性。在此类应激下的凋亡促进肿瘤抗原暴露；焦亡通过caspase-1和GSDMD激活诱导炎症细胞因子；坏死性凋亡通过MLKL寡聚化促进膜破裂；铁死亡由ROS诱导的脂质过氧化引起。释放的DAMP，包括CRT、HMGB1、ATP和IL-1β，通过PRR激活DC，增强抗原呈递、DC成熟和随后的CTL反应。这些事件有助于原位癌症疫苗接种的整体疗效。该图使用BioRender生成（https://biorender.com）。

凋亡通常是耐受性的，尽管在内质网应激下，它可能暴露CRT，促进DC吞噬。然而，它缺乏炎症细胞因子，通常限制CTL激活和记忆。坏死性凋亡导致DAMP释放，包括HMGB1、ATP和DNA。这些分子激活TLR4和cGAS-STING通路，促进I型IFN产生和CD8⁺ T细胞招募。虽然坏死性凋亡增强抗原可用性、白细胞浸润和DC交叉呈递，但细胞因子（如IL-12和IL-15）的强效诱导通常依赖于额外的PRR参与或促炎信号，这些信号通过核因子κB（NF-κB）和干扰素调节因子（IRF）信号通路完全激活DC。特别是，TLR4和RIPK1-TAK1复合物下游的NF-κB信号诱导促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-12p40）和共刺激分子的转录，而通过cGAS-STING-TBK1轴的IRF3激活促进I型干扰素产生，上调抗原加工机制，并支持IL-15表达。总之，这些途径将坏死性凋亡的DAMP释放与先天免疫激活联系起来，确保有效的DC许可和随后的细胞毒性T细胞反应启动。药物如GSK3145095（也称为化合物6）是高度选择性、口服生物可利用的小分子受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）抑制剂，在阻断RIP1激酶依赖性细胞通路中具有强效活性。临床前评估显示，GSK3145095不仅抑制RIP1介导的坏死性凋亡信号，还在离体胰腺癌培养中促进肿瘤抑制性T细胞表型。化合物6目前正在胰腺腺癌和其他选定实体瘤的I期临床研究中。

焦亡导致孔形成并释放ATP、HMGB1、IL-1β和IL-18。这些促进DC招募、共刺激分子表达和抗原呈递。IL-1β驱动Th17分化；IL-18和IL-12诱导IFN-γ和Th1极化。这些细胞因子增强CD8⁺ T细胞和NK细胞功能。焦亡可以将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，并增强免疫检查点治疗。基于Gasdermin的纳米颗粒、超声介导的焦亡诱导以及与STING激动剂的组合已显示出协同治疗效果。通过将免疫原性抗原释放与内在佐剂性相结合，焦亡作为强效效应机制，可增强原位疫苗接种疗效。

铁死亡释放丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4-HNE），这些物质激活DC并增强交叉呈递。它消耗M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM），破坏转化生长因子-β（TGF-β）信号，并促进趋化因子如CXCL1，导致CD8⁺ T细胞和NK细胞浸润增加，调节性T细胞（Treg）和髓系来源抑制细胞（MDSC）减少。与免疫检查点阻断（ICB）或先天激动剂联合使用时，铁死亡改善“冷”或凋亡抵抗性肿瘤中的效应反应。虽然PCD途径支持ICD，但它们的临床转化取决于精确递送、受控激活和免疫协调。

免疫佐剂：抗原呈递细胞的强效激活
传统疫苗佐剂是简单、成熟的物质，如矿物盐、乳剂和某些微生物或植物提取物。最广泛使用的是铝盐（明矾），包括氢氧化铝和磷酸铝。使用明矾的商业疫苗包括白喉、破伤风和百日咳疫苗，甲型和乙型肝炎疫苗，以及几种儿科疫苗。水包油乳剂如MF59和AS03使用角鲨烯油与表面活性剂，延长抗原释放。油包水产品包括Montanide ISA系列，广泛用于兽医和实验疫苗。弗氏佐剂含有矿物油和灭活分枝杆菌，由于其高毒性而仅限于临床前研究。植物皂苷（特别是QS-21）用于高级佐剂系统如AS01（用于Shingrix）。这些佐剂主要通过储库形成和一般免疫激活起作用，而非定向免疫谱。这与设计用于精确和靶向免疫调节的现代佐剂形成对比。在传统框架中，免疫佐剂被定义为具有内在免疫调节特性的分子或化合物，当与抗原共同施用时，与单独抗原施用相比，显著放大抗原特异性免疫反应。传统上，它们在疫苗设计中的作用主要集中于增强免疫反应的幅度，而不精确控制其定性属性。这些佐剂广泛刺激免疫，通常通过先天免疫途径的一般性激活，改善整体免疫原性，无论功能谱如何。虽然它们可以影响参数如T辅助细胞偏向（Th1与Th2）、CD8⁺细胞毒性与CD4⁺辅助T细胞比例或抗体同种型分布，但这些效应通常是偶然的而非有意设计的。

现代免疫佐剂是合理设计的制剂，能够引发高度特异性和强效的免疫反应，超越了传统佐剂的广泛、一般性效应。这些佐剂不仅加速和放大免疫激活，还促进强大、持久的免疫记忆，特别是T细胞记忆，这对于针对复杂病原体和癌症的持久保护至关重要。它们扩展了抗体和T细胞反应的广度、特异性和功能亲和力，使疫苗能够对抗广泛的疾病靶点。在机制上，现代免疫佐剂通常作为PAMP或DAMP模拟物，靶向APC上的模式识别受体（PRR），启动精确的先天免疫信号级联。APC激活适应性免疫依赖于三个信号：抗原呈递（信号1）、共刺激分子的上调（信号2）和细胞因子介导的T细胞极化（信号3）。虽然单独的信号1可能导致耐受，但协调的信号1和2是T细胞激活所必需的，而所有三个信号对于完全功能性反应都必不可少。免疫佐剂通过激活PRR和下游转录因子如NF-κB和IRF，特异性驱动信号2和3，导致细胞因子产生和共刺激标志物表达增加。这种分子协调促进完全的树突状细胞成熟和多种抗原特异性T细胞亚群的有效启动，包括Th1、Th2、Th17和细胞毒性CD8⁺ T细胞。总之，现代免疫佐剂作为精确的加速器和指导者，使下一代疫苗能够诱导持久、快速和靶向的保护性免疫。

在原位癌症疫苗的背景下，免疫佐剂在协调强效T细胞介导的抗肿瘤免疫中发挥核心作用。直接施用到肿瘤部位后，现代免疫佐剂激活DC和其他APC上的PRR。这种激活驱动DC成熟、共刺激分子上调以及促炎细胞因子分泌，这些对于肿瘤相关抗原在MHC分子上的有效加工和呈递至关重要。这种增强的抗原呈递使得肿瘤特异性CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的启动和克隆扩增成为可能。这些CTL浸润免疫抑制性肿瘤微环境（TME），通过MHC-I嵌入的肿瘤抗原肽识别癌细胞，并通过穿孔素/颗粒酶途径诱导凋亡。免疫佐剂还促进Th1分化，支持CTL功能和持久性，并诱导生成对持久肿瘤控制至关重要的长寿记忆T细胞。这不仅导致局部肿瘤消退，还导致全身性抗肿瘤反应，有时产生远隔效应（靶向远处未注射病灶）。

尽管有这些益处，但免疫佐剂单一疗法的疗效从根本上受限于内源性肿瘤抗原的免疫原性。许多肿瘤细胞不会经历充分的免疫原性细胞死亡，导致抗原和危险信号弱或不充分，无法在高度免疫抑制的TME中启动强大、持久的适应性反应。TME的免疫抑制特征常常削弱T细胞效应功能，诱导耗竭，并抑制细胞毒性活性。因此，免疫佐剂驱动的激活必须足够强大，以克服这些局部抑制信号，促进持续的效应分化并防止T细胞耗竭。总之，免疫佐剂机制的系统性整合点燃了“冷”TME，将其转化为免疫学上活跃的场所，能够招募、激活和维持抗肿瘤T细胞反应。这一缺陷常常转化为不完全的肿瘤排斥、有限的免疫记忆形成以及不足的全身性效果，从而限制了仅使用免疫佐剂方法的临床实用性。

这些见解为将免疫佐剂与ICD诱导剂相结合提供了令人信服的理论依据，ICD诱导剂增强TAA和危险信号的释放，以更有效地启动和维持T细胞介导的抗肿瘤免疫。将免疫佐剂与ICD诱导剂结合克服了这些障碍，确保释放充足的肿瘤相关抗原和DAMP，进一步增强DC激活和抗原呈递。这种协同策略产生更深刻和持久的抗肿瘤免疫反应，建立强效记忆T细胞群体，并显著增加有效肿瘤根除和长期保护的可能性。

虽然ICD诱导剂如阿霉素、奥沙利铂或光动力疗法释放DAMP（包括CRT、ATP和HMGB1），但由于肿瘤微环境中的免疫抑制信号（如IL-10、TGF-β或PGE2）限制了共刺激信号和抗原呈递，由此产生的APC激活常常不完全。因此，需要强效免疫佐剂来克服这些障碍，通过加强DC激活、增强抗原摄取和维持ICD衍生肿瘤抗原的交叉呈递。

原位癌症疫苗将ICD诱导剂与靶向PRR的佐剂整合，创造一个“危险信号丰富”的肿瘤环境，其中内源性DAMP和外源性PAMP共同刺激先天传感器。这种双重激活建立了时空协调的DC成熟、CCR7介导的向肿瘤引流淋巴结的迁移，以及多克隆CD8⁺和CD4⁺ T细胞启动。基于甘露聚糖的纳米胶囊通过共同参与Dectin-2和TLR4，增强Th17极化细胞因子反应和CD40上调，是此类双作用平台的范例。

在Lindsay M. Scheetz等人的研究中，包裹多西他赛的合成高密度脂蛋白（sHDL）纳米颗粒与TLR9激动剂CpG联合使用，以增强化疗诱导的ICD疗效。sHDL纳米载体通过SR-B1介导的摄取将多西他赛高效递送至MC38结肠腺癌细胞，CpG的加入显著放大了抗肿瘤效果。在七只接受DTX-sHDL/CpG治疗的小鼠中，两只出现完全肿瘤消退，且在整个治疗过程中未观察到任何动物的全身毒性。该研究清楚表明，在结肠癌中，将多西他赛和CpG共同递送至sHDL纳米颗粒上比多西他赛单药治疗具有更优的抗肿瘤功效，凸显了化疗ICD诱导剂与PRR激动剂的组合如何协同增强先天激活并促进持久抗肿瘤免疫。

除DC和巨噬细胞外，B细胞也是原位癌症疫苗触发的适应性免疫激活的重要组成部分。记忆B细胞及其抗体构成免疫记忆的核心组成部分，即使在缺乏持续刺激的情况下也能维持抗原识别。然而，B细胞在癌症免疫治疗反应中的确切作用仍不完全清楚。新出现的证据表明，除了抗体产生外，B细胞还可以通过呈递抗原和为T细胞提供共刺激信号来增强抗肿瘤免疫。尽管大多数原位癌症疫苗研究侧重于T细胞介导的抗肿瘤效应，但越来越多的证据表明，由B细胞和抗体介导的体液免疫也可能对抗肿瘤反应做出有意义的贡献。临床前研究表明，强效的原位癌症疫苗方案（如将放疗与瘤内免疫细胞因子和免疫检查点阻断相结合）可以诱导内源性肿瘤特异性IgG产生，并产生手术切除单独无法观察到的体液免疫记忆。在鼠B78黑色素瘤模型中，这种组合性原位癌症疫苗触发了B细胞的强效激活，导致类别转换的IgG反应，这些抗体特异性识别B78和B16细胞之间共享的肿瘤抗原。血清抗体滴度在治疗三周内升高，并在肿瘤再挑战后进一步增强，表明记忆B细胞反应的建立。这表明B细胞可以通过原位癌症疫苗以T细胞依赖性方式被激活，可能有助于抗体依赖性细胞毒性、APC对抗原的摄取或长期免疫监视。

除了经典的蛋白质或肽抗原外，B细胞还可以识别异常糖基化肿瘤表面蛋白上的聚糖依赖性表位。MUC1糖肽疫苗由具有肿瘤特异性糖基化的合成MUC1串联重复序列组成，正在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和其他癌症的临床试验中进行评估。这些疫苗旨在引发双重免疫反应，将抗体介导的聚糖依赖性表位识别与针对MHC分子呈递的肽区域的细胞毒性T细胞反应相结合。此外，新开发的疫苗制剂采用MUC1糖肽作为B细胞表位，与异源T细胞表位或Toll样受体（TLR）激动剂偶联，以协同增强体液和细胞抗肿瘤免疫。总体而言，这些见解将B细胞从被动的抗体生产者重新定位为原位癌症疫苗诱导免疫的积极参与者，其中它们对聚糖依赖性表位的识别以及对T细胞反应的支持共同扩大了抗肿瘤免疫的范围和持久性。

利用完整的肿瘤抗原多样性进行T细胞激活
癌症免疫治疗的有效性从根本上依赖于免疫系统识别和消除肿瘤抗原的能力。然而，肿瘤异质性和免疫压力常常导致抗原丢失或克隆演化，限制了依赖狭窄抗原库的方法的有效性。

与传统癌症疫苗需要预先识别和配制特定TAA不同，原位癌症疫苗导致肿瘤的完整抗原谱在其天然和免疫学相关背景下原位释放。虽然TAA已被研究，但其临床实用性受限于免疫耐受。相比之下，肿瘤特异性新抗原、翻译后修饰表位、癌胚蛋白和隐蔽肽（表2）代表了互补靶点，为免疫识别提供了更广泛且更无偏倚的抗原景观。针对这种多样化抗原库诱导多克隆T细胞反应不仅增强肿瘤清除，还有助于减轻由抗原丢失或克隆演化驱动的免疫逃逸。此外，将原位疫苗接种与互补策略（如免疫检查点阻断以防止T细胞耗竭或重复瘤内给药以维持抗原暴露）相结合，可以进一步加强免疫监视并改善长期肿瘤控制。表2 构成原位完整抗原谱的肿瘤抗原类别。

通过原位癌症疫苗接种释放的完整抗原谱包含多种肿瘤相关抗原类别（图5），每种都具有独特的免疫学特征和治疗意义。原位癌症疫苗接种诱导完整肿瘤抗原谱的释放。局部肿瘤破坏导致多种肿瘤衍生抗原释放到肿瘤微环境中，包括TAA（如HER2/neu）、肿瘤特异性新抗原（来自突变、基因融合或剪接事件）、翻译后修饰抗原（如改变的MUC1糖型）、癌胚抗原（如NY-ESO-1、AFP）、病毒抗原（如HPV、EBV）和隐蔽抗原。这些共同构成APC摄取和交叉呈递可用的完整抗原谱。该图使用BioRender生成（https://biorender.com）。

经典的TAA，如癌胚抗原（CEA）和人表皮生长因子受体2/神经（HER2/neu），是恶性细胞中异常过表达的自体衍生蛋白。尽管这些抗原可以具有免疫原性，但其源自自身组织使其受到中枢和外周耐受的限制，这通常需要同时使用免疫检查点抑制剂（如抗程序性细胞死亡蛋白1（抗PD-1）抗体）才能实现有效的细胞毒性T细胞激活。

相比之下，肿瘤特异性新抗原源自体细胞突变、基因融合或异常剪接事件，且正常组织中不存在，因此具有高度免疫原性。由于它们对宿主免疫系统而言完全是新抗原，因此新抗原被识别为非自身，并且可以引发强效的CTL反应，而不受中枢或外周免疫耐受的影响。与TAA（通常是肿瘤中过表达的自体蛋白，存在于正常或免疫豁免组织中）不同，新抗原是肿瘤独有的，作为免疫治疗靶点提供更高程度的特异性和安全性。新抗原的免疫学优势使其成为个性化癌症疫苗的理想候选。例如，个性化新抗原疫苗NEO-PV-01与PD-1抑制剂的组合已用于治疗晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌或膀胱癌患者。临床试验NCT03953235评估了SLATEv1，一种针对常见驱动突变（如KRAS和TP53）的现货型共享新抗原疫苗。尽管该组合耐受性良好并诱导了新抗原特异性CD8⁺ T细胞反应，但临床疗效有限，客观缓解率为0%，中位无进展生存期为1.9个月。

此外，肿瘤经常发生翻译后修饰，如异常糖基化、磷酸化、瓜氨酸化或乙酰化。这些改变可以产生区分肿瘤抗原与其正常对应物的新表位，并可被疫苗选择性靶向。一个充分表征的例子是异常糖基化的粘蛋白-1（MUC1），一种粘蛋白，在肿瘤中携带截短的O-连接聚糖，如Tn和唾液酸-Tn。这些肿瘤相关的糖型暴露了正常组织中不存在的肽骨架和聚糖依赖性新表位。聚糖依赖性表位主要由B细胞和抗体识别，因为其抗原性源于肿瘤特异性碳水化合物结构的三维构型。然而，异常糖基化也可以改变抗原加工和MHC装载，产生能够以独特方式与T细胞受体（TCR）结合的糖肽新抗原。另一方面，多项研究支持在癌症免疫治疗中靶向糖基化的潜力。例如，靶向PD-L1糖型已成为改善免疫检查点治疗的有前景的策略，并且最近的努力旨在将PD-L1上的聚糖表位纳入抗PD-L1/PD-1治疗分层的生物标志物组合中。

另一个重要类别包括癌胚抗原，如甲胎蛋白（AFP）和纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）。这些蛋白质通常在胚胎发生期间表达，但在癌症中重新表达，同时在成人组织中基本保持沉默，使其成为基于TCR和肽的免疫治疗的理想靶点。

隐蔽和非经典抗原构成一类肿瘤相关肽，源自非传统基因组和转录组区域。最近的免疫肽组和翻译组分析研究已证实，隐蔽肽在多种恶性肿瘤（包括胶质母细胞瘤、黑色素瘤、急性髓系白血病（AML）和胰腺导管腺癌（PDAC））中内源性加工并呈现在MHC I类分子上。在AML中，Cai等人鉴定了超过10,000个非经典MHC相关肽（ncMAP），其中许多源自非编码区，如长链非编码RNA（lncRNA）和UTR，其中一些显示出强免疫原性。同样，在非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤（AT/RT）中，MHC I类免疫肽组的显著部分由源自未注释开放阅读框和替代阅读框的隐蔽肽组成。

除了自身和突变衍生的肿瘤抗原外，致癌病毒编码的抗原提供了另一种非自身、高度免疫原性的靶点。病毒如人乳头瘤病毒（HPV）和Epstein-Barr病毒（EBV）与几种癌症的发生有因果关系。治疗性HPV疫苗，特别是那些靶向高风险亚型（如HPV16/18）的E6和E7癌蛋白的疫苗，已被证明能激活CD8⁺ T细胞并诱导针对感染癌细胞的定向细胞毒性。这些有希望的结果表明，病毒抗原可以作为原位癌症疫苗所利用的抗原谱的一部分，这些抗原在免疫原性细胞死亡期间在其天然免疫学背景下被释放和加工。这使得能够针对广泛的肿瘤抗原进行T细胞的从头启动，其中许多抗原可能不被传统方法识别。结果是诱导多样化和多克隆的CD8⁺ T细胞反应，由表位扩散和多种记忆T细胞亚群