认知健康衰老中氧化应激韧性与维生素D受体多态性及其与Nrf2依赖性基因表达的关联研究

《Antioxidants》：Vitamin D Receptor Polymorphisms and Their Association with Nrf2-Dependent Gene Expression in Oxidative Stress Resilience in Cognitively Healthy Aging

　　

维生素D受体(VDR)发挥对人体健康至关重要的多效性作用，并调节核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)的转录，Nrf2是细胞抗氧化防御系统的关键调节因子。多态性代表个体间变异的主要来源，并可能影响对氧化应激的易感性。VDR多态性ApaI (A > C)和TaqI (T > C)已被证实与疾病易感性相关；然而，它们在衰老过程中氧化应激反应中的作用仍不清楚。本研究在认知健康的智利老年人的外周血单核细胞(PBMCs)中，评估了ApaI和TaqI多态性与氧化应激诱导的细胞死亡易感性，以及VDR-Nrf2信号轴内基因表达之间的关联。使用实时PCR（TaqMan SNP基因分型检测）进行VDR基因分型，通过流式细胞术评估H2O2暴露后的PBMC活力，并通过定量PCR(qPCR)确定基因表达水平。对于ApaI，与C等位基因（AC或CC）携带者相比，A等位基因的纯合携带者在H2O2暴露后显示出更高的PBMC活力（p < 0.0068），以及更高信使RNA(mRNA)表达水平的Nrf2（p = 0.0176）及其下游基因HMOX1（p = 0.0070）和GST（p = 0.0047）。对于TaqI，与风险T等位基因（TC或TT）携带者相比，保护性C等位基因的纯合携带者表现出更高的PBMC活力（p < 0.0465）和更高的Nrf2（p = 0.0324）、HMOX1（p = 0.0206）和GST（p = 0.0029）表达。这些发现提供了新的证据，表明VDR多态性可能通过调节Nrf2依赖性基因表达来调节抗氧化反应，提示了认知健康老年人氧化应激韧性的遗传决定因素。

维生素D是一种经典上与Ca²⁺稳态、骨骼形成和健康相关的多功能开环甾族激素。近年来，其多效性已被广泛认可。维生素D的基因组效应是与其高亲和力核受体——维生素D受体(VDR)相互作用介导的。维生素D与VDR结合后，与视黄酸X受体(RXR)形成异二聚体，进而 recruit 辅调节蛋白复合物并结合到维生素D反应元件(VDREs)上。随着年龄增长，维生素D水平下降，这与多种衰老相关疾病（如轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)）的发生风险增加密切相关。单核苷酸多态性(SNPs)是导致个体间遗传差异的最常见原因。在人类VDR基因中已描述了大量SNPs，其中ApaI (A > C)和TaqI (T > C)位于3'非翻译区(3'UTR)附近，可能影响mRNA的稳定性和定位。既往研究表明，ApaI的A等位基因和TaqI的C等位基因表现出更好的骨密度反应、较低的衰弱指数，并且与较低的遗忘型MCI(AD的前驱阶段)发生风险相关，可能是对抗AD发展的保护性因素。此外，维生素D通过转录调节核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)在调节抗氧化通路中发挥重要作用。Nrf2是细胞抗氧化反应的主调节因子，通过控制谷胱甘肽和硫氧还蛋白(TRX)抗氧化系统的基因表达来应对氧化应激。然而，VDR基因多态性对氧化应激易感性以及通过VDR-Nrf2轴介导的细胞抗氧化反应效率的影响仍不清楚。氧化还原稳态的失调和细胞韧性的降低越来越被认为是与衰老过程中认知衰退相关的早期特征。为了填补这一空白，研究人员开展了一项研究，探讨ApaI和TaqI VDR多态性对认知健康老年人外周血单核细胞(PBMCs)中氧化应激诱导的细胞死亡易感性，以及Nrf2及其下游靶点表达的影响。该研究发表于《Antioxidants》。研究结果揭示了VDR遗传变异在细胞抗氧化反应中的潜在参与，对理解健康衰老的遗传决定因素具有重要意义。在样本队列方面，研究招募了30名来自智利圣地亚哥的认知健康老年人（60岁及以上，大部分为女性，平均年龄72.27岁），该队列平均血清25-羟基维生素D水平为24.02 ng/mL，处于维生素D不足范围内，且蒙特利尔认知评估(MoCA)得分表明认知表现完好。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下方法：通过TaqMan SNP基因分型检测技术对VDR的ApaI和TaqI多态性进行基因分型；使用密度梯度离心法分离PBMCs，并将其暴露于不同浓度的H₂O₂中，利用流式细胞术结合碘化丙啶(PI)染色评估细胞活力；运用定量PCR(qPCR)技术检测Nrf2及其下游靶基因HMOX1和GST的mRNA表达水平；并使用共聚焦显微镜进行免疫荧光分析以评估Nrf2蛋白表达水平。

在研究结果方面：
1. VDR多态性促进对氧化应激的差异性反应：通过将不同基因型的PBMCs暴露于浓度递增的H₂O₂中进行研究。得出结论：对于ApaI多态性，与C等位基因(AC/CC)携带者相比，AA基因型个体的细胞活力在20 μM和100 μM H₂O₂暴露下显著更高；对于TaqI多态性，与TC/TT携带者相比，CC基因型个体在50 μM H₂O₂暴露下表现出更高的细胞活力。双因素方差分析显示，在不断增加的氧化应激水平下，保护性等位基因纯合携带者始终表现出更高的细胞活力。

2. VDR多态性调节Nrf2及其靶基因的表达：通过qPCR技术分析基因表达。得出结论：对于ApaI多态性，AA基因型个体的Nrf2、HMOX1和GST的mRNA表达水平显著高于AC/CC基因型个体。对于TaqI多态性，CC基因型个体的Nrf2、HMOX1和GST表达也显著高于CT/TT携带者。这支持了保护性等位基因差异性调节VDR靶基因抗氧化反应的假设。

3. VDR ApaI-TaqI单倍型与差异性氧化应激反应相关：将ApaI和TaqI作为相关联的单倍型进行分析，携带两个保护性等位基因(A和C)的组合被视为保护性单倍型，携带风险等位基因(C和T)则为风险单倍型。得出结论：在20 μM和100 μM H₂O₂暴露后，保护性单倍型个体的细胞活力显著高于风险单倍型。同时，通过免疫荧光分析发现，保护性单倍型携带者的Nrf2蛋白表达水平显著高于风险单倍型携带者。

在讨论与结论部分，研究人员指出，尽管ApaI和TaqI多态性被认为是沉默突变，但其对氧化应激反应的调节可能通过影响mRNA稳定性或与其他功能变异连锁不平衡来实现。研究结果表明，VDR多态性与PBMCs中氧化应激诱导的细胞死亡易感性差异相关，这种保护作用可能是通过对氧化应激反应基因的差异性调节介导的。携带保护性等位基因的个体展现出增强的细胞活力和更高的抗氧化基因表达水平。研究人员提出了“氧化应激韧性”的概念，即细胞在过量氧化应激暴露下，通过协调激活抗氧化防御和细胞保护机制来保持活力和功能稳态的能力。ApaI的A等位基因和TaqI的C等位基因代表了赋予氧化应激韧性并促进健康衰老的VDR变异。综上所得出的研究结论为：VDR多态性与差异性的Nrf2依赖性氧化应激反应相关，这表明VDR基因的遗传变异可能调节细胞对氧化挑战的韧性。这种变异性可能有助于解释认知健康老年人应对氧化应激能力的差异。了解抗氧化反应的遗传决定因素可以为促进健康衰老和长寿的个性化策略制定提供支持。此外，维生素D状态或补充可能会根据VDR基因型的不同而差异性地影响氧化应激反应。