综述：抗氧化系统与热休克反应在多胁迫条件下水生动物中的作用

《Antioxidants》：Role of Antioxidant Systems and Heat Shock Response in Aquatic Animals Under Multistress Conditions

　　

多胁迫概念是近年来为更好地理解现实环境中环境胁迫对动物影响而发展的一种新方法。在自然界中，动物在每日和季节时间尺度上同时暴露于环境波动中，胁迫因子之间的相互作用可产生拮抗、相加或协同的生理反应。因此，仅研究受控实验室条件下单一胁迫因子的实验可能无法反映自然栖息地中的反应。本综述讨论了多胁迫因子对氧化还原代谢和热休克蛋白（HSP）反应的影响，重点关注水生环境。研究人员在实验室和现场研究中讨论了多胁迫方法，重点强调了主要非生物胁迫因子，如盐度变化、太阳辐射、温度和低氧可用性（包括缺氧和空中暴露）。通过文献中的实例总结了多胁迫因子对HSPs和抗氧化剂的影响。最后，考虑了社会胁迫和生活史阶段在塑造对多非生物胁迫因子反应中的作用。总体而言，本综述强调了多胁迫方法在实验室和现场实验中的应用，重点突出了涉及内源性抗氧化剂和HSPs的关键胁迫反应，两者均由活性氧物种（ROS）引发。

1. 一般引言（General Introduction）
本综述探讨了动物如何通过聚焦自由基代谢（以下简称氧化还原代谢）和热休克反应来应对各种环境胁迫因子，如温度波动、缺氧和紫外线辐射。直到二十年前，绝大多数关于氧化胁迫的研究仅分析单一非生物胁迫因子，偶尔考察生理事件的时间进程。这种方法通常过于人为，因为胁迫强度随时间波动，且多种非生物和生物胁迫因子可能同时相互作用，正如本文详细讨论的那样。

2. 生态生理学中的多胁迫概念（The Multistress Concept in Ecophysiology）
动物对多胁迫因子反应的研究在毒理学和生态学领域已有百余年的历史，但在生态生理学和比较生理学中是一个相对较新的概念。因此，不同学科常使用不同术语描述相同概念。为澄清概念，研究人员编制了多胁迫研究关键术语的词汇表，并定义了本综述中的使用方式。在生态生理学中，研究者传统上让生物体在给定处理中暴露于恒定条件。然而，水生环境在空间、时间和尺度上高度可变，使其动物群暴露于大量非生物波动中。一些可作为胁迫因子的环境条件包括：温度波动、氧可用性变化（如缺氧区）、高紫外线辐射、盐度变化及pH变化。此外，水生生物还暴露于其他重要胁迫因子，如污染物、竞争和捕食压力、入侵物种以及物理干扰。生物对这类环境挑战的反应及其对性能的影响已通过大量实验室实验方法研究，但通常仅考虑单一非生物因子。然而，即使实验室研究通过纳入多胁迫因子来近似自然动态，也常常无法捕捉到自然界中观察到的真实暴露情况。因此，在静态实验中使用生物模型仅阻碍了预测自然条件下生物影响的准确性，尤其是在持续变化的气候/天气条件下。目前，需要确定多胁迫因子对自然环境中不同生物细胞和生理反应的现实影响，其中多种环境条件同时波动。现场研究结合模拟现场条件的受控实验室暴露，可揭示动物对多相互作用胁迫因子的复杂生理反应。

2.1. 胁迫因子相互作用的特征（Characterizing Stressor Interactions）
多胁迫效应研究在环境科学领域（如生态生理学）中具有重要意义。通常，这类研究将生物暴露于每种胁迫因子的高水平以最大化并观察短期效应，同时将另一组生物同时暴露于所有因子的联合作用。这意味着多胁迫因子同时作用的效果可能与单独观察到的效果完全不同。为分类胁迫因子间的相互作用，首先需要确定孤立胁迫因子的生理效应。对于动物物种而言，“胁迫条件”的定义取决于其环境条件的最适范围及其应对波动的可塑性和适应能力。一旦确定每种重要环境变量的孤立效应，可尝试将不同胁迫因子相互作用的生理效应分为三类：相加效应、拮抗效应和协同效应。文献中广泛记录了胁迫因子拮抗、相加或协同效应的实例。尽管研究和理解胁迫因子相互作用很重要，但这一分类框架存在若干局限性，使其难以普遍应用。胁迫因子的强度、持续时间和暴露顺序决定了相互作用是相加、拮抗还是协同的。因此，这些因素的变化可能导致完全不同的生理结果。从生物化学角度看，生理反应在不同组织和分析参数之间也可能存在差异。因此，虽然这种分类很重要，但它高度依赖于具体情境，并可能随实验设计而轻易改变。

2.2. 交叉保护（Cross-Protection）
交叉保护是与多胁迫密切相关的概念，即暴露于第一胁迫因子使生物体更好地抵抗第二胁迫因子。从生物化学角度看，交叉耐受发生在首次暴露上调胁迫反应（如抗氧化防御和HSPs）时，从而增加对后续胁迫暴露的耐受性。这些反应背后的共享信号通路称为交叉对话。由于许多研究领域从不同角度研究多胁迫下的动物，“交叉保护”和“交叉耐受”可能具有不同含义。本综述采用Rodgers等人提出的定义，其中交叉保护指涵盖交叉耐受和交叉对话的综合现象。交叉保护机制的激活取决于瞬时因素（如暴露持续时间、强度、频率和顺序）和慢性因素（如性别和生活阶段）。已有假设认为，交叉保护在胁迫因子以可预测和频繁顺序发生的环境中进化。因此，在实验室实验中研究和定义交叉保护现象具有挑战性，尽管它们对于阐明单个胁迫因子的孤立生理效应很重要。另一方面，现场研究捕捉了现实环境条件下的生理反应，但难以确定哪种胁迫因子对观察到的反应影响更大。这两种方法的优缺点主要与因果关系有关。因此，研究交叉保护现象的最佳方法是整合实验室和现场实验，以分析孤立和整合的胁迫因子反应。

3. 自然和现场实验中的多胁迫方法（The Multistress Approach in Natural and Field Experiments）
研究环境因素如何影响生理性状的现场研究通常包括在自然环境中进行直接观察、收集生理反应和行为数据，并监测相关环境变量。自然实验的优势在于能够揭示生物在现实条件下（包括自然环境的复杂性和不可预测性）如何反应。现场研究可涵盖短期到长期项目，以及从生理反应的分子分析到种群层面适应性和恢复力的更广泛研究。成功的现场研究需要仔细规划、准备和执行，以确保收集的数据准确且有意义，从而理解生理与环境之间的相互作用。自然条件的不可预测性是现实，而实验室实验方法并不总能复制和控制自然环境中发生的大量生物和非生物胁迫因子。现场研究可由研究者对环境变量进行最小干预（现场实验）或完全不干预（自然实验）。一些采用自然实验方法的潮间带研究已确定了采集动物可能具有更显著生化反应的时间窗口。水生动物已成为许多自然实验方法研究的对象，包括海胆、贻贝、腹足类和淡水鱼。这些研究均分析了自然环境中与氧浓度和/或可用性变化相关的胁迫因子与其他潜在胁迫因子（如温度和盐度）的组合效应。它们得出结论，缺氧是驱动动物抗氧化反应的主要胁迫因子。然而，在一些研究中，记录更广泛的环境变量允许在生化反应与环境波动之间建立更详细的相关性。这表明在采样期间多点记录环境条件的重要性，因为这允许在生化反应与自然栖息地中波动的胁迫因子之间进行更精确的相关性分析。另一种方法是现场实验，它与自然实验有许多相似之处，但涉及控制一个或几个变量，以避免不希望的剧烈效应使现场研究过于侵入性。例如，研究人员可以搭建围栏或笼子隔离动物，保护它们免受捕食，同时仍让它们在采样期间暴露于自然环境条件。与实验室实验相比，自然和现场实验如今因不同时间尺度（每日、季节和年际）的环境变异性而变得相关，提供了对非生物和生物因素如何影响动物生理和行为在自然界中的更现实理解。每个多胁迫研究必须考虑对所研究物种既相关又有影响力的变量，其中在较短时间尺度（如每日）波动的变量通常比较长时间尺度（允许生理适应）的变化施加更大的生理负担。例如，在潮间带，温度和紫外线辐射（UV-R）的波动是关键因素，而盐度通常在更季节性的尺度上变化，即时相关性较低。然而，在河口环境中，盐度成为关键变量，因其显著且频繁的波动。同样，在红树林中，由于淡水和海水的混合，结合潮汐循环和沉积物组成中的低氧可用性，盐度波动也很关键。另一方面，如太阳UV-R等变量，由于茂密的植被冠层，影响较小。单个胁迫因子的相对重要性因环境而异，其组合效应必须根据生物生存的生态背景进行解释。因此，每个研究中多胁迫的概念取决于自然栖息地、行为模式、所研究物种的生理特征以及时间尺度。水生生物暴露于广泛的环境变量，这些变量可单独或组合作为胁迫因子。其中，盐度、氧合（缺氧和高氧）、温度、太阳辐射和污染物的波动是塑造水生物种生理反应的一些最具影响力的因素。以下小节重点介绍这些关键环境胁迫因子及其在塑造水生动物生理和氧化还原反应中的作用。来自各种自然和现场多胁迫实验的证据总结在表1中，详细说明了评估的胁迫因子。这些原位和环境研究涵盖了多个门的水生生物，包括刺胞动物、环节动物、软体动物、节肢动物、棘皮动物和脊索动物，栖息地多样，包括海洋潮间带、河口、水柱、潮池、热带泻湖和水库。

3.1. 盐度（Salinity）
环境盐度是一个关键的非生物因子，可深刻影响生理和细胞反应，特别是在沿海和河口生态系统中定居的固着海洋无脊椎动物，其中盐度波动可能突然且反复。由于无法移动，固着生物必须调节渗透平衡以维持内部稳态，这不仅需要激活主动运输机制，还会导致能量消耗增加和细胞胁迫。同时，盐度波动损害线粒体完整性，导致高代谢需求组织中的能量功能障碍。先前在河口或红树林系统中的多因子研究（表1）包括监测环境盐度，因为已知该因子通过组织离子浓度的变化引起氧化损伤，具有高代谢成本。例如，已观察到河口蛤Solen regularis在调节血淋巴渗透压方面具有更好的能力，尤其是在高渗条件下（>25 psu），主要归因于与低渗条件（<15 psu）相比更高的SOD、CAT和GPx合成。对于许多河口生物，低盐度耐受性（<22 psu）意味着通过闭壳（如Ostrea chilensis）或通过足部肌肉收缩抵抗基底（如帽贝Crepipatella dilatata）与外部环境隔离，这最终导致厌氧代谢激活和乳酸积累。然而，正是返回可耐受的河口盐度（>20 psu）触发了高水平的氧化损伤和蛋白质羰基水平，因为动物通过壳开合重新与环境连接，从而允许将外套腔缺氧水替换为高氧含量水（7.0 mg O2 L^-1）。尽管渗透顺应允许海洋和河口生物与周围环境保持等渗平衡，但某些生物如贻贝、牡蛎和蛤对盐度波动的耐受范围较窄（狭盐性）。因此，超出生理耐受极限的盐度水平变化导致它们与周围环境隔离，从而最小化渗透损伤。虽然这保护了软组织免受离子水平变化的影响，但与周围环境隔离也意味着外套腔内产生的微环境将很快变成缺氧环境。因此，在高潮期重新连接周围环境将由于从厌氧到有氧代谢的转变而产生ROS过度生成，这种情况需要这些动物准备氧化胁迫（POS）作为最小化氧化损伤水平的策略。上述证实了盐度不仅是直接引起高水平氧化损伤的因素，而且降低的盐度水平可导致软组织破坏。然而，通过与环境隔离可以防止这种损伤，这导致可用氧水平的剥夺，进而引发新问题：缺氧后复氧。

3.2. 环境辐射（Environmental Radiation）
环境UV-R包含影响地球表面并穿透不同水生生态系统的太阳电磁辐射的不同波段。环境辐射可分为紫外线B辐射（UV-B; >280–320 nm）、紫外线A辐射（UV-A; >320–400 nm）和光合有效辐射（PAR; >400–700 nm）。由于其诱导光氧化损伤的有害效应，UV-B已被广泛研究，特别是在缺乏物理保护的水生生物中，如棘皮动物幼虫、海葵、珊瑚、涡虫、头足类和腹足类。例如，墨西哥La Boquita礁共生珊瑚Pocillopora capitata的季节性光氧化反应显示，在夏季当UV-R、水温和叶绿素达到年度峰值时，脂质过氧化（TBARS）升高。在同一背景下，在Quempillén河口进行的现场多因子（盐度、温度、UV-B、UV-A和PAR辐射）实验表明，潮汐变化引起的盐度波动并未显著影响共生海葵Anthopleura hermaphroditica的氧化损伤水平，尽管UV-R降低了其光合性能（Fv/Fm、ETRmax和Ek）。类似地，Lister等人[17]表明，与仅暴露于PAR水平的幼虫相比，暴露于UV-B辐射的海胆Tripneustes gratilla幼虫产生了更高水平的氧化损伤和畸形。辐射参数的日变化如上述可因季节性而加剧，因为从冬季到夏季的过渡使南半球中纬度地区（新西兰）的UV-B剂量增加23%。上述一致，在Quempillén河口进行的现场研究表明，冬季和夏季之间的季节变化可导致温度水平、UV-B辐射剂量（280–320 nm）和PAR辐射（400–700 nm）分别增加2倍、10倍和6倍，导致A. hermaphroditica中脂质过氧化和蛋白质羰基水平增加4倍和20倍。大多数评估UV-R对水生无脊椎动物影响的多因子自然和现场实验（表1）已考虑至少通过每日周期估算UV-B辐射；然而，取决于研究问题，必须考虑环境PAR，特别是如果生物模型是利用PAR进行光合作用的共生复合体（例如，海葵、珊瑚、海蛞蝓、软体动物）。在高PAR辐照度条件下，光合中心的过度激发以及光合生物中线粒体和叶绿体电子传递系统可导致电子泄漏到分子氧，导致ROS形成和随后的氧化损伤。最近一项关于共生裸鳃类Elysia velutinus和Elysia ornata的研究（它们依赖从藻类中隔离的叶绿体）表明，高PAR水平诱导了氧化损伤的显著增加。然而，这些生物向遮荫区域逃逸或在特定身体区域积累叶绿体，作为对抗过量PAR的防御策略。在大型藻类中，对高PAR暴露的反应包括动态光抑制过程，其特征是光合效率的瞬时降低和热能耗散，旨在最小化氧化损伤。在设计评估太阳辐射对动物细胞或生理影响的自然和现场实验时，必须考虑太阳辐射的时间周期性。太阳辐照度在每日和季节尺度上变化，显著调节生物经历的光氧化胁迫的幅度。在每日尺度上，辐照度通常在正午附近达到峰值，与光氧化损伤的最高水平相吻合，而季节模式塑造了全年光胁迫的强度和持续时间，导致可变水平的氧化胁迫。这类现场研究中一个经常被低估的因素是瞬时大气条件的影响，特别是碎云的存在，可暂时增强辐照度水平并放大光氧化效应；云边缘的光散射瞬时增加了到达地表的直接和漫射太阳辐射。这种效应可引发细胞损伤的急性增加，有时超过完全晴朗天气下的水平。

3.3. 温度（Temperature）
温度是多胁迫因子研究中的核心因素，因为它对变温生物的所有生理、生化和细胞过程具有全面影响。热波动可改变代谢率、影响膜流动性、改变酶动力学并破坏氧化还原平衡，从而调节对缺氧、盐度、酸化或太阳辐射等其他胁迫因子的脆弱性和生理反应能力。在联合胁迫背景下，温度不仅作为直接胁迫因子，还作为调节因子，可根据暴露的强度、持续时间和序列放大或减轻共现因子的效应。例如，升高的温度可能增强缺氧条件下的ROS产生，或增加盐度变化期间对渗透损伤的易感性。因此，将现实的热梯度纳入多胁迫因子实验设计对于理解生物在气候变化情景下的真实耐受能力和生理阈值至关重要。毫无疑问，温度水平在每日周期和更广泛的季节模式中波动（表1）。例如，在Quempillén河（39°S）的河口海葵A. hermaphroditica中，季节对氧化反应的影响表明，在夏季，脂质过氧化水平升高是温度和紫外线B辐射增加的结果，而在冬季，正午期间的潮汐减少因连续降水导致的河口盐度降低产生了对脂膜的主要损伤水平。虽然温度是与UV-R辐射相关的非生物因子，但两者的同时存在并非隐含。到达地表的温度来自太阳发射的红外辐射，它直接或间接地影响生物体，通过增加酶促反应速率并在超过生理耐受范围时产生高水平的氧化损伤。因此，自然环境中随机波动，如沿海地区的海洋热浪（MHWs），可产生氧化损伤水平的剧烈变化。这证实了温度是主要的代谢调节因子，可产生海洋生物中的高水平氧化损伤。

3.4. 氧可用性（实验室和现场）（Oxygen Availability (In Laboratory and Field)）
缺氧在氧可用性在季节或日尺度上波动的水生系统中尤为重要。现场研究允许研究人员调查缺氧如何与其他非生物因子相互作用以影响氧化还原平衡，因为氧可用性的变化通常与其他环境因素（如温度、UV辐射和pH）的变化同时发生，这些因素可相互作用并加剧缺氧。例如，在许多沿海和潮间带生态系统中，氧气水平白天因光合作用而升高，有时达到高氧水平，夜间因呼吸作用而下降，可能导致缺氧，并暴露许多潮间带物种于缺氧-复氧循环。在这些环境中，升高的温度（也可能与增加的UV辐射相关）可降低溶解氧水平，同时刺激水生物种的代谢需求增加。在潮间带，缺氧也在低潮时自然发生，称为功能性缺氧。由于固着生物无法迁移，它们根据对空中暴露期间加剧的温度和UV辐射波动的生理耐受性分布在沿海，这一现象称为垂直分带。为了在这些极端环境变化中生存，这些动物进化出了整合的生化策略，其中氧化还原代谢作为主要防线，以减轻潮汐返回时复氧引起的氧化损伤。虽然缺氧在许多系统中自然发生，但人为驱动因素（如污染、营养输入增加）已导致缺氧发生在历史上未发生的区域或强度，促进了死亡区和富营养化的扩张。由富营养化驱动的缺氧现被认为是海洋生态系统中的主要胁迫因子，能够引起大规模死亡事件，并在季节、偶发或持续时间尺度上发生。已知缺氧和复氧通过促进ROS产生、抗氧化和线粒体防御机制来改变氧化还原平衡。此外，大量文献强调了氧化还原反应如何受温度、pH和盐度的高度调节。例如，经受不同时间空中暴露结合温度变化的珍珠贝（Pteria penguin）显示出对短期空中暴露的SOD、CAT、TAOC和GSH-Px活性的快速增加，表明适应反应（交叉保护）。然而，在30°C下维持12小时时，存活率降至20%以下，表明温度升高的有害效应。在C. gigas的情况下，当适应低盐度时，与暴露于高盐度相比，缺氧和复氧后线粒体性能得到改善，但线粒体ROS外排水平更高。贻贝Mytilus coruscus表现出对低氧可用性和pH降低的抗氧化反应，这两种胁迫因子的效应是相加的，当两种胁迫因子同时发生时，SOD、CAT和ACP水平最高。综合这些研究，它们表明对缺氧的反应受到额外胁迫因子的高度调节。虽然某些物种可能单独适应缺氧，但无法完全理解自然主义缺氧在与其他常见环境胁迫因子隔离时的后果，这些胁迫因子通常与缺氧同时发生。因此，现场和自然研究对于捕获动物如何在多胁迫条件下应对缺氧的更现实画面以及跨分类群及其对这些胁迫因子生理反应的巨大多样性非常重要。

4. 动物胁迫和热休克蛋白（Animal Stress and Heat Shock Proteins）
4.1. 热休克蛋白概况（General Information on Hsps）
自1962年Ferruccio Ritossa在果蝇幼虫唾液腺中发现热休克蛋白（Hsps）以来，对其重要功能的持续研究巩固了它们在动物细胞中作为对内外部胁迫信号的常见分子胁迫反应的关键作用。虽然在非胁迫条件下，Hsps执行管家职能和蛋白质质量控制调节，但多种胁迫因子（如温度、pH、盐度等）可导致蛋白质变性、错误折叠蛋白降解和蛋白质聚集，进而诱导Hsp产生，使其成为环境胁迫的关键指标，对动物的整体适应性产生负面影响。尽管在动物中环境、非生物和生物胁迫因子诱导Hsp产生的确切机制尚不完全清楚，但普遍认为它们极大地扰乱细胞稳态，从而改变生理过程如生长、繁殖和生存。它们的细胞保护作用包括正确的蛋白质折叠和细胞器跨细胞膜转运。Hsp诱导已被提出作为调节稳态以响应环境胁迫的潜在连接，使生物能够适应和生存。虽然各种胁迫刺激产生的常见信号很可能是蛋白质损伤，但细胞胁迫感知机制的操作尚不完全清楚。可诱导的Hsp表达由热休克转录因子（HSFs）调控。具体而言，各种胁迫因子（如升高的温度、缺氧、盐度波动、酸化、污染物和氧化胁迫）的作用导致HSFs获得DNA结合活性到热休克元件（HSE），这是热休克基因启动子区域的一个结构域，导致Hsp产生和细胞积累。具体来说，当HSF通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）接受可逆磷酸化时，它被转运到细胞核，在那里三聚化并结合HSE，导致Hsp转录激活。然而，在非胁迫细胞中，由于Hsp通过与寡聚化结构域（HR）相互作用进行负调控，HSF1以单体状态存在。随着ROS水平升高，Hsp70和Hsp90表面的SH基团被氧化，导致Hsp从HSF1解离并从HSF1复合物释放，随后HSF1三聚化和Hsp转录激活。因此，HSF1作为汇聚于蛋白质组不稳定性的多样化环境胁迫信号的中心整合因子。尽管Hsp诱导通常被认为是增强细胞稳态和胁迫耐受性的保护性反应，但其激活与显著的能量成本相关。具体而言，Hsps的合成及其ATP依赖性伴侣功能（蛋白质折叠、重折叠和降解）可大幅增加能量需求。在ATP产生可能已受限的胁迫条件下，维持热休克反应可能导致影响生长、繁殖、免疫功能和其他能量需求过程的生理权衡。因此，应在生物的能量容量以及胁迫暴露的持续时间和强度的背景下考虑Hsp诱导的益处。这个复杂的分子伴侣网络主要根据其氨基酸组成、分子量和特定细胞功能分为两大类：高分子量和低分子量Hsps（60至110 kDa和15至43 kDa）。虽然两组都是ATP依赖性的，但它们的细胞功能不同：高分子量Hsp功能是通过ATP依赖性变构组织结合和折叠新生蛋白，包括组装、运输和降解错误折叠肽，但它们在细胞信号传导、免疫反应调节和防止凋亡中也发挥关键作用，从而促进胁迫下的细胞存活，这对维持稳态至关重要；低分子量Hsp功能已在ATP非依赖性分子伴侣中记录，作为细胞胁迫的早期反应者，通过结合受损或未折叠的蛋白质并防止其不可逆聚集。它们维持蛋白质稳态、降低毒性并支持细胞存活。

4.2. 多胁迫因子对HSPs的影响：实验室实验（Multistressors’ Effect on HSPs: Laboratory Experiments）
虽然在生态生理学领域一些研究集中在单一胁迫因子及其组合对无脊椎动物和脊椎动物生理性能的影响，但只有少数涉及热休克反应（HSR）作为潜在胁迫指标的研究。尽管如此，Hsps在维持蛋白质稳态、响应各种胁迫因子、参与细胞通路（如信号转导、细胞周期和凋亡调控）以及其在癌症和神经退行性疾病等疾病中的作用目前正被强调。以下可找到强调这些分子生态生理学意义的研究（表3）。关于无脊椎动物物种，已在许多实验室模拟中检验了多胁迫效应，例如在浮游动物、双壳类和端足类中。具体而言，由于关键食草动物Daphnia magna在过去五十年中面临其环境中剧烈的化学变化，温度作为单一胁迫因子以及与食物水平和杀虫剂负荷的组合，在存在多胁迫因子时的温度斜坡处理后导致Hsps的下调和上调。后者归因于由于不同胁迫因子在不同方向上影响Hsp表达的高可塑性。海洋变温生物如东部牡蛎（Crassostrea virginica）也常暴露于多环境胁迫因子，如温度和重金属污染。这些胁迫因子（急性温度胁迫和/或长期Cd暴露）对该牡蛎物种的联合效应表明，同时暴露于两种胁迫因子产生的Hsp水平相较于单独一种胁迫因子被抑制，这表明来自金属污染环境的牡蛎热耐受性降低。温度升高对所有水生生物（包括端足类，它们代表淡水大型无脊椎动物中最丰富和功能上重要的群体）可能显著应激。暴露Gammarus pulex于10°C温度升高（从15°C到25°C）和微孢子虫感染导致Hsp70蛋白水平增加，以及其他胁迫因子，表明这种增加可能对宿主抵御急性温度胁迫具有保护作用。在多胁迫效应已研究的其他变温生物中，脊椎动物是重点，主要关注鱼类。在此背景下，将经济重要鱼类S. aurata暴露于24°C和28°C的升高温度（对比18°C对照）和降低的pH水平（由于水中溶解的CO2增加）导致仅由一种胁迫因子引起的低氧血症状况加剧，正如Hsp70和Hsp90的持续表达所证明。类似地，对鲨鱼鲶鱼物种Pangasinodon hypophthalmus的双胁迫因子效应也已检验。具体而言，在铅（Pb 4 ppm）和高温（34°C）胁迫下饲养的鱼类，喂食膳食硒纳米颗粒（Se-NPs，1 mg/kg，2 mg/kg）或不含Se-NPs（0 mg/kg），与仅暴露于一种胁迫因子效应的鱼类相比，表现出对鱼类健康状态的破坏性影响和增加的胁迫指标，如Hsps。然而，膳食Se-NPs表现出增强整体性能和减轻P. hypophthalmus多胁迫的能力。虽然上述研究中两种胁迫因子之一为温度，但在Chinook鲑鱼Oncorhynchus tshawytscha中，检验了拟除虫菊酯农药esfenvalerate和有机磷农药chlorpyrifos以及病毒暴露的效应。联合处理后观察到最高的Hsp水平，表明病毒和农药之间的相加效应。总体而言，现有证据强调了Hsps作为暴露于多胁迫因子的敏感生物标志物的生态生理学意义，反映了细胞在不利条件下维持蛋白质稳态的努力。Hsp表达在分类群和胁迫因子组合中的变异性可能源于胁迫感知通路的差异激活，包括HSF介导的转录调控、氧化还原信号和参与蛋白质折叠、重折叠和降解的能量依赖性伴侣活性。这些分子反应可通过限制蛋白质错误折叠和聚集促进细胞保护，但在长期或严重胁迫下也可能揭示能量约束和细胞稳态失调，最终导致适应不良的结果。需要进一步结合分子、生理和生态学方法的整合研究，以阐明胁迫反应网络如何在全球环境变化的综合压力下塑造生物体恢复力。

4.3. 多胁迫因子对HSPs的影响：自然和现场实验（Multistressors’ Effect on HSPs: Natural and Field Experiments）
虽然Hsps的重要性此前已在实验室导向的研究中广泛讨论，但它们也被强调为定义极端热极限的有力工具，用于研究自然环境条件对多种动物物种生物学和生理学的影响，这些物种从无脊椎动物（如双壳类、蜗牛和甲壳类）到脊椎动物（如鱼类和两栖类）不等。考虑到大量实验室研究已证明物种在恶劣环境条件下启动细胞胁迫反应的能力，本节旨在强调这些条件与热休克反应（HSR）之间的关系。环境监测和管理必须考虑这些效应，以避免季节性混淆变量的干扰。然而，Hsp表达仍然高度可变；它受组织类型、热胁迫的强度和持续时间以及每个物种特定热历史的调节。在潮下带马贻贝Modiolus modiolus中，来自新罕布什尔州Shoals群岛10米深度的季节性采集显示，Hsp70浓度在冬季高于夏季样品，表明在冷适应过程中发生其他季节性调整时，如整体代谢和抗氧化补偿，必须维持蛋白质伴侣功能。Hsp诱导的模式在地中海贻贝Mytilus galloprovincialis中不同，温度的影响明显，且反应模式在后闭壳肌和外套膜中呈双相：Hsp72和Hsp90在2月至4月间增加，保持恒定直至5月底，此后逐渐增加至6月至8月的夏季高温，表明蛋白质周转或蛋白质损伤增加。在潮间带贻贝Mytilus trossulus中，动物经受宽范围体温（夏季约10°C至35°C），夏季采集和潮间带贻贝表现出比冬季采集和潮下带个体更高的Hsp70水平。这些结果表明，夏季高温导致夏季适应贻贝中细胞蛋白的变性增加，尽管热休克蛋白水平增加，但变性仍持续存在。陆生蜗牛物种Helix lucorum显示出广泛的垂直分布，导致种群暴露于不同的季节性温度变化。来自两个不同种群（海平面0米和奥林匹斯山1250米）以及相互种群交换后的个体，在不同种群之间以及暴露于不同海拔的相同种群之间，表现出季节性改变的Hsp70和Hsp90水平。然而，相同种群在其原生栖息地或适应不同栖息地的个体表现出相对相似的表达模式，支持根据每个物种生活史诱导特定蛋白质的证据。与上述软体动物物种相反，在温带对虾物种Palaemon elegans中，季节以极其多变的方式影响了几种生化因子——上升、下降或保持不变——从而根据季节采用不同的生化策略：虽然过氧化氢酶活性和脂质过氧化在夏季增加，持续诱导的Hsp70水平代表了一种涉及蛋白质质量控制系统的季节性适应机制；这对于经常暴露于不断变化环境的潮间带种群尤为重要，其中温度在季节比较中具有主要变化。除了环境温度变化外，生物还应对其他季节性变化的变量，如UV-R。来自清澈高山湖泊的浮游动物桡足类Cyclops abyssorum tatricus在2月冰盖期间表现出hsp70基因表达的显著上调，与其光保护水平（如类菌胞素氨基酸和类胡萝卜素）呈负相关，因为此时光保护防御处于年度最低点。尽管冰提供了物理屏蔽防止UV，但这些发现表明Hsp70表达受季节可塑性调节——由水温和生物内部防御状态共同驱动——确保在高度可变的阿尔卑斯生态系统中生存。另一项研究关注了从污染和未污染地点采集的灰鲻鱼Mugil cephalus的肝脏线粒体中线粒体Hsp70（mtHsp70）水平，在季风和夏季期间。暴露于污染地点慢性环境胁迫的鱼类过度表达了mtHsp70、p-HSF1（核部分）和Hsp90α（伴随更高的脂质过氧化），特别是在夏季，以应对增加的季节性和污染胁迫，与未污染区域相比。与之前研究的Hsp70水平相反，无论污染因素如何，Hsp90α和p-HSF1在季节上均存在差异，其水平在夏季增加（但在污染河口中增加更高）。因此，Hsp90似乎与Hsp70差异反应：它可能被认为是M. cephalus中更敏感的胁迫指标，因为它也受季节性环境胁迫诱导。在另一种鱼类S. aurata中，Hsp诱导和MAPK激活——表现出以组织特异性为特征的季节模式——发生在夏季水温峰值之前，尽管随后温度升高，但并无进一步增加。这种由冷适应触发的激活可解释为鱼类应对夏季记录的（超出Tc）高环境海水温度的预备策略。类似于其他养殖物种如S. aurata，红鲷Pagrus pagrus生理反应季节模式可能支持广温性概念。特别是在季节性现场适应过程中，Hsp70和Hsp90以及其他属于凋亡和自噬通路的胁迫指标在春季与海水温度升高同步表现出高水平。然而，在冷适应过程中几种生物指标的升高表明了对变化的现场条件的复杂生化反应。两栖类Pelophylax ridibundus在8个月的现场适应期间（11月至6月）采用了不同的策略。具体而言，在心脏和腓肠肌中，水蛙的Hsp70和Hsp90诱导因冬季冬眠期间的整体代谢抑制而保持在低水平。从该阶段恢复诱导了这两种蛋白质水平的增加，强调了它们的细胞保护作用和适应环境胁迫的能力，可能作为从越冬中苏醒时准备氧化胁迫（POS）策略。在自然或半自然条件下评估生物体的生理和细胞反应需要全面理解多种环境胁迫因子如何在空间和时间尺度上相互作用。与通常隔离单一变量的传统实验室实验不同，现场和自然实验更好地捕捉了这些生物栖息地中生态复杂性和不可预测性。环境参数如温度、盐度、氧可用性和太阳辐射（包括UV-R和PAR）并非独立作用；相反，它们动态相互作用，通常协同作用，产生无法从单胁迫因子研究中预测的生物效应。此外，环境波动的时间结构，包括昼夜和季节周期，以及间歇性太阳暴露或极端天气事件等事件的影响，必须在评估氧化胁迫和其他生理终点时加以考虑。正如在广泛物种和生态系统中所展示的，基于稳健环境监测的现实多胁迫方法对于揭示真正的耐受阈值、“预期性”机制如POS反应的激活以及支撑在不断变化环境中生存的适应策略至关重要。

5. 动物胁迫和氧化还原代谢（Animal Stress and Redox Metabolism）
有氧生命进化出了一个复杂的信号系统，该系统依赖于活性物种、可氧化靶标、中和剂（抗氧化系统）和修复机制之间动态相互作用导致的生物分子靶标的氧化和还原，构成活性物种相互作用组。这些相互作用支撑了氧化还原信号，其中活性物种作为受调节的信使，对正常生理功能至关重要，而不仅仅是代谢的有害副产物。这种“氧化还原密码”将代谢与细胞信号整合，调节广泛的细胞过程，包括细胞增殖、代谢、基因表达和免疫反应。因此，氧化还原代谢对于维持正常细胞和生理功能至关重要。

5.1. 氧化胁迫和抗氧化剂（Oxidative Stress and Antioxidants）
活性氧物种（ROS）在代谢过程中自然产生，特别是来自线粒体电子传递链和其他氧化还原活性酶系统，如NADPH氧化酶。细胞依赖由抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物还蛋白）、蛋白质（如硫氧还蛋白和金属硫蛋白）和低分子量抗氧化剂（如谷胱甘肽和抗坏血酸）组成的抗氧化系统来管理ROS水平并保持氧化还原信号，同时防止不受控制的氧化。抗氧化系统如谷胱甘肽和硫氧还蛋白依赖系统的功能高度依赖于还原当量NADPH，因为NADPH是谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶将氧化型谷胱甘肽和硫氧还蛋白还原为还原态所需的。鉴于其反应性，即使存在多层抗氧化系统，ROS对生物分子的氧化也无法完全防止，即使在非病理条件下也是如此。因此，细胞采用多种机制来修复或替换氧化损伤的生物分子，包括DNA修复途径、蛋白质中氧化残基的还原和蛋白质降解。这里，NADPH再次对于为生物合成途径提供还原当量以替换受损分子以及作为修复酶的辅因子至关重要，例如醛还原酶。氧化还原代谢以这样的方式运作，即使在非胁迫条件下，生物分子也会发生一定程度的氧化修饰，并发挥其稳态功能，这种状态定义为氧化性eustress。例如，定量氧化还原蛋白质组学表明许多蛋白质半胱氨酸在组成型上仅部分还原，表明在基础条件下存在显著氧化部分，强调受控氧化不一定对细胞功能有害。然而，在某些条件下，例如暴露于环境胁迫因子，活性物种的产生可能超过抗氧化系统的管理能力，导致过度氧化修饰，通常是不可逆的并导致功能丧失，表征氧化性distress。无论主要原因是什么，氧化还原平衡的破坏触发转录反应，如由氧化还原敏感转录因子Nrf2、FoXOs和NF-κB介导的反应。这些最终上调编码抗氧化酶、解毒蛋白和NADPH生成酶的基因。这些基因的产物有助于将氧化还原平衡带回其氧化性eustress的基线状态。实验上，氧化还原代谢通常通过测定转录、蛋白质或活性水平的抗氧化酶