使用活性氧响应性水凝胶靶向白细胞介素-6信号促进脊髓损伤后再生

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Targeting Interleukin-6 Signaling with Reactive-Oxygen-Species-Responsive Hydrogel to Promote Regeneration after Spinal Cord Injury

　　

脊髓损伤（SCI）触发过度的炎症反应，其特征是多种炎症因子的上调，这些因子阻碍神经再生和功能恢复。白细胞介素-6（IL-6）是SCI后病变中观察到的一种早期且关键的炎症介质。拮抗该信号通路为减轻创伤后早期炎症和继发性损伤提供了一种有前景的策略。研究人员发现，病变中神经元和小胶质细胞中IL-6受体（IL-6R）的特异性激活，表明它们对微环境中早期上调的IL-6信号有反应。在体外，中和小胶质细胞中的IL-6信号有效减轻了它们在条件培养基中对神经元轴突生长的抑制作用。基于此，研究人员开发了一种活性氧响应性水凝胶，用于局部持续递送托珠单抗（一种IL-6R拮抗剂），并将其植入完全横断SCI模型中。在体内，持续阻断IL-6R有效减少了早期炎症细胞浸润，调节小胶质细胞向抗炎表型极化，并促进病变内的神经再生。重要的是，这种治疗干预促进了SCI小鼠后肢功能的长期恢复。本研究强调了精确靶向早期炎症细胞因子信号通路（特别是IL-6）以改善SCI后结局的治疗潜力。

论文解读：靶向白细胞介素-6信号以促进脊髓损伤后再生

**研究背景与问题**

脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统疾病，导致损伤平面以下瘫痪和感觉丧失。初始创伤引起细胞破坏和血管破裂，同时伴随细胞因子表达增加和免疫细胞浸润，最终触发过度的神经炎症，导致额外的细胞死亡。调节过度的炎症反应是神经保护治疗的主要目标。白细胞介素-6（IL-6）是SCI后最早上调的炎症因子之一，其表达在损伤后迅速升高，一周内降至基线水平。既往研究表明，IL-6可能参与急性炎症反应、反应性胶质增生和神经退行性过程。然而，关于IL-6在SCI修复中的作用存在争议：一些研究显示IL-6信号阻断可抑制巨噬细胞活化并增强运动功能恢复，而另一些研究则表明IL-6对轴突再生和运动功能恢复具有有益作用，凸显了该细胞因子的双重角色。这些研究均通过静脉或鞘内给药分析治疗效果，不同于局部药物递送。因此，精确定位损伤部位的局部递送对于阐明IL-6在SCI修复中的确切作用至关重要。

**研究内容与结论**

本研究开发了一种负载托珠单抗（tocilizumab，一种IL-6受体拮抗剂）的活性氧响应性水凝胶，用于局部持续递送，并在完全横断SCI小鼠模型中评估其疗效。研究发现，IL-6主要来源于损伤后的小胶质细胞和星形胶质细胞，其受体（IL-6R）仅在神经元和小胶质细胞中表达，表明IL-6主要靶向这两种细胞类型。体外实验显示，直接添加IL-6或IL-6预处理的小胶质细胞条件培养基显著抑制原代脊髓神经元的轴突生长，而托珠单抗预处理可逆转这一抑制效应，使轴突长度恢复至未处理组水平。在体内，负载托珠单抗的水凝胶植入后，持续阻断IL-6R有效减少了早期中性粒细胞和巨噬细胞浸润，促进了小胶质细胞从促炎（M1）表型向抗炎（M2）表型极化，并改善了病变内的炎症微环境。基于此，托珠单抗处理在损伤后7天促进了神经再生，包括Tuj-1⁺轴突和Map-2⁺成熟神经元数量的增加，这些轴突共表达兴奋性（vGlut2）或抑制性（GAD67）神经递质标记物。体外RNA测序分析表明，托珠单抗调节了神经元中与轴突导向和谷氨酸能突触形成相关的基因表达，并促进了功能性突触的形成。长期观察（2个月）显示，早期托珠单抗干预减少了病变内硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）的沉积，增加了功能性轴突的数量，并显著改善了后肢运动功能（Basso小鼠量表评分）。本研究强调了精确靶向早期炎症细胞因子信号通路（特别是IL-6）在改善SCI后结局中的治疗潜力。论文发表在《BIOMATERIALS RESEARCH》。

**主要技术方法**

本研究采用的主要关键技术方法包括：（1）建立小鼠完全横断SCI模型，动物来源为中南大学动物实验中心提供的C57BL/6J雄性小鼠（6-8周龄）；（2）制备活性氧（ROS）响应性水凝胶，由季铵化壳聚糖（QCS）和单宁酸（TA）组成，负载托珠单抗，通过ROS响应实现局部持续释放；（3）原代神经元提取：从新生C57BL/6J小鼠（1-2天龄，来源为斯莱克动物公司）脊髓中分离培养；（4）BV2小胶质细胞系培养（购自Procell）；（5）组织免疫荧光染色，使用多种抗体标记细胞类型和蛋白；（6）RNA测序（RNA-seq）及生物信息学分析，包括差异表达基因（DEG）鉴定、GO和KEGG富集分析；（7）行为学评估：采用Basso小鼠量表（BMS）评分评价后肢运动功能。

**研究结果**

**IL-6主要靶向脊髓损伤后的小胶质细胞和神经元**
通过免疫荧光染色，研究人员在SCI后1、3、7天检测到IL-6在病变中快速升高（1天时阳性面积占16.865%±0.982%），主要来源于小胶质细胞和星形胶质细胞；其受体IL-6R仅在神经元和小胶质细胞中表达，提示IL-6主要作用于这两种细胞类型。

**托珠单抗在体外拮抗过量的IL-6以促进轴突再生**
在原代神经元培养中，直接添加IL-6将平均轴突长度降至对照组的约1/4（29.42 μm vs. 136.44 μm），而托珠单抗预处理使轴突长度恢复并超过对照组（184.81 μm）。使用IL-6预处理的BV2小胶质细胞条件培养基也抑制了神经元轴突生长，托珠单抗预处理同样逆转了这一效应（轴突长度恢复至170.97 μm，与对照组无显著差异）。

**基于ROS响应性水凝胶的递送系统实现托珠单抗的稳定释放**
研究人员制备的QCS-TA水凝胶具有良好粘附性、可注射性和ROS响应性，在体外炎症条件下15天内释放约90%的负载药物，适合局部持续递送。

**托珠单抗促进病变中小胶质细胞的抗炎极化**
在损伤后3天，托珠单抗处理组（Toc+Gel）病变中Ly6G⁺中性粒细胞（41.60个/视野）和F4/80⁺巨噬细胞（72.2个/视野）的浸润数量显著低于凝胶对照组（分别约98.8和145.2个/视野）和未处理对照组（约94.8和168.6个/视野）。小胶质细胞中促炎M1表型（iNOS⁺）比例降低（约1.337%），而抗炎M2表型（CD206⁺）比例增加约3倍。体外BV2细胞RNA-seq显示，托珠单抗处理组的DEGs富集于炎症反应和先天免疫应答相关GO条目，表明其调节了促炎向抗炎的转变。

**托珠单抗促进体内早期神经再生**
在损伤后7天，Toc+Gel组病变中Tuj-1⁺轴突面积占比（0.111%）显著高于凝胶对照组（0.027%）和未处理对照组（0.024%），Map-2⁺成熟神经元数量（37.8个/视野）约为对照组的2倍。这些再生轴突共表达vGlut2或GAD67，提示其具有功能属性。

**托珠单抗在体外促进功能性突触形成**
对原代神经元进行RNA-seq分析，发现过量IL-6改变了部分基因转录谱，而托珠单抗处理导致神经元转录模式与对照组显著不同，DEGs富集于轴突导向和谷氨酸能突触形成相关通路。免疫荧光验证显示，托珠单抗促进了Tuj-1⁺vGlut2⁺轴突和Tuj-1⁺Syn⁺突触的形成，同时调节了神经元中炎症相关基因表达。

**托珠单抗支持长期轴突生长和后肢功能恢复**
在损伤后2个月，Toc+Gel组病变中硫酸软骨素蛋白聚糖沉积（CS56⁺面积比）降至约7.031%，而两个对照组约为14.6-15.0%，表明早期干预减轻了纤维瘢痕形成。Tuj-1⁺轴突面积占比（0.335%）显著高于对照组，且这些轴突共表达vGlut2或GAD67。BMS评分从35天起，处理组小鼠后肢运动功能持续优于对照组，直至56天。

**讨论与结论**

讨论部分指出，炎症反应是SCI后二次损伤的主要驱动因素，但免疫细胞（如T细胞和小胶质细胞）也可能参与组织修复，识别关键调控通路并选择性调节免疫反应是挑战。托珠单抗靶向的IL-6R-JAK2-STAT3通路被认为是潜在调控枢纽，其不仅与炎症因子产生相关，也参与轴突再生。既往研究显示持续鞘内注射托珠单抗可减少M1巨噬细胞分泌IL-6，恢复血管内皮细胞紧密连接，促进SCI修复。本研究采用的递送系统无法特异性靶向单一细胞类型，未来可设计具有单细胞靶向功能的药物以进一步解析IL-6R阻断对局部细胞的影响。此外，IL-6的病理生理高峰主要在损伤后1天，长期应用托珠单抗或在IL-6恢复正常后阻断信号通路是否减弱修复效果仍需探讨，因此设计合理的治疗时间窗对未来临床应用至关重要。关于IL-6的双重作用，本研究中体外实验显示IL-6直接处理或通过小胶质细胞条件培养基均抑制了脊髓神经元轴突生长，与之前背根神经节神经元中IL-6诱导再生的结果相反，可能源于原代细胞分离中的胶质细胞污染或神经元特异性反应。小胶质细胞作为最早反应者，托珠单抗仅部分抑制其活化，是否通过小胶质细胞介导的与其他免疫细胞互作促进组织修复需要进一步研究。

**研究结论**
本研究证实，脊髓损伤后，神经元和小胶质细胞是急性期对升高的IL-6最早反应的细胞。局部应用负载托珠单抗的缓释水凝胶中和损伤区域的IL-6信号，可减少免疫细胞浸润、减轻免疫反应，同时促进轴突再生和突触形成，最终改善SCI小鼠的预后。本研究强调了精确靶向早期炎症细胞因子信号通路（特别是IL-6）以改善SCI后结局的治疗潜力。