细胞内Ca2+调节人iPSC来源心肌细胞中PKA的区室化与动力学

《International Journal of Molecular Sciences》：Intracellular Ca2+ Modulates PKA Compartmentalization and Dynamics in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes

　　

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的自律性由耦合的Ca²⁺时钟和膜时钟协调控制，通过局部Ca²⁺释放（LCRs）和环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信号通路实现。研究人员通过测量细胞质和线粒体中PKA的动力学及其与Ca²⁺的相互作用，研究了PKA在hiPSC-CM能量代谢中的作用。研究人员检验了三个假设：（i）Ca²⁺激活的PKA信号调节能量平衡；（ii）腺苷酸环化酶（AC）活性与自发搏动速率相关；（iii）PKA区室化是Ca²⁺依赖性的。研究人员还将hiPSC-CMs与兔窦房结细胞（SANCs）进行了比较。主要发现如下：（i）PKA抑制（H-89）、Ca²⁺螯合（BAPTA）或线粒体Ca²⁺阻断（Ru360）导致能量失衡；（ii）H-89诱导细胞质、线粒体基质和外线粒体膜中产生区室化的PKA活性；（iii）用BAPTA螯合Ca²⁺全局性降低PKA活性；（iv）hiPSC-CMs和兔SANCs中PKA动力学及Ca²⁺依赖性调节相似。总之，细胞内Ca²⁺介导的PKA区室化存在于hiPSC-CMs和兔SANCs中。

**论文解读：细胞内Ca²⁺调节人iPSC来源心肌细胞中PKA区室化与动力学**

**研究背景、问题与目的**
心脏自律性由Ca²⁺时钟和膜时钟的耦合机制调控，其中局部Ca²⁺释放（LCRs）和cAMP/PKA信号通路发挥关键作用。人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）作为疾病模型、药物测试和再生医学的重要工具，其能量代谢调控机制尚不明确。尽管此前在hiPSC-CMs中观察到LCRs和胞质cAMP动力学，但PKA的时空动力学及其与Ca²⁺的相互作用尚未被研究。此外，线粒体Ca²⁺在调节hiPSC-CMs节律中的作用已被证实，但PKA是否参与能量平衡调控以及PKA在不同细胞区室中的区室化特征仍不清楚。本研究旨在探讨：（i）Ca²⁺激活的PKA依赖性信号是否为能量平衡的重要调节因子；（ii）Ca²⁺激活的AC活性是否与自发搏动速率相关；（iii）PKA区室化是否受细胞内Ca²⁺浓度调控。研究还比较了hiPSC-CMs与兔窦房结细胞（SANCs）中PKA动力学和Ca²⁺依赖性调节的相似性。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用荧光共振能量转移（FRET）技术，使用靶向细胞质、外线粒体膜（OMM）和线粒体基质（MM）的PKA活性传感器（AKAR4探针），实时监测单细胞水平PKA动力学。通过药理学工具（如FSK激活AC、H-89抑制PKA、BAPTA螯合Ca²⁺、Ru360阻断线粒体Ca²⁺摄取、伊伐布雷定（IVA）阻断If电流）调节信号通路，并记录黄素蛋白自发荧光（反映能量状态）和Ca²⁺瞬变（使用Fluo-4 AM）。采用免疫染色检测AC1和AC8表达。细胞来源：hiPSC-CMs来自健康女性（克隆24.5）和新生儿包皮（克隆FSE-5m）的hiPSC分化，30-60天龄；兔SANCs从新西兰白兔心脏分离。

**研究结果**
**2.1. Ca²⁺激活的PKA依赖性信号在hiPSC-CMs能量平衡中的作用**
通过测量黄素蛋白自发荧光（反映线粒体氧化还原状态），发现PKA抑制剂H-89、Ca²⁺螯合剂BAPTA或线粒体Ca²⁺阻断剂Ru360均显著降低荧光信号，表明ATP供应与需求失衡；而AC激活剂FSK或DMSO对照无影响。结论：Ca²⁺激活的PKA信号是能量平衡的重要调节因子。

**2.2. hiPSC-CMs胞质PKA动力学**
使用FRET探针AKAR4测量胞质PKA活性，确定基线活性为最大活性（FSK处理）与最小活性（H-89处理）之间的13%±6%。FSK增加PKA活性，H-89降低活性。磷酸酶抑制剂（OA、钙调磷酸酶A）对PKA活性影响微弱，PDE1抑制剂MIMX无改变，但IBMX增加活性。结论：PKA活性受AC和PDE调控，磷酸酶作用较小。

**2.3. hiPSC-CMs胞质、MM和OMM中PKA区室化**
使用靶向OMM（yTom-AKAR4）和MM（4Cox8-AKAR4）的探针，发现基线PKA活性在OMM和MM均高于胞质（归一化后分别为0.37±0.08和0.32±0.13 vs 0.13±0.06）。FSK在各区室中增加PKA活性的幅度相似，而H-89在OMM的抑制作用强于胞质和MM。结论：PKA活性在胞质和线粒体区室中差异分布，呈现区室特异性。

**2.4. Ca²⁺激活的AC是hiPSC-CMs中PKA活性的重要调节因子**
免疫染色证实hiPSC-CMs表达AC1和AC8。BAPTA浓度依赖性降低所有区室（胞质、OMM、MM）的PKA活性（分别降低21%、20%、17%）。BAPTA与FSK共处理时，PKA活性低于单独FSK处理；BAPTA与H-89共处理时，活性更低。结论：Ca²⁺通过激活AC调节PKA活性，且影响PKA区室化。

**2.5. 线粒体Ca²⁺激活的AC是hiPSC-CMs中PKA活性的重要调节因子**
Ru360（线粒体Ca²⁺阻断剂）单独处理不影响MM中PKA活性，但Ru360与FSK共处理时活性低于单独FSK，与H-89共处理时活性与单独H-89相似。结论：线粒体Ca²⁺也参与调节MM中PKA活性。

**2.6. M时钟扰动对hiPSC-CMs中PKA活性的影响**
伊伐布雷定（IVA，If阻断剂）单独处理不改变胞质PKA活性，但IVA与FSK或H-89共处理时，PKA活性变化幅度低于单独药物处理。结论：时钟耦合程度影响PKA活性。

**2.7. hiPSC-CMs胞质PKA活性与搏动速率的相关性**
对多种药物（FSK、H-89、BAPTA、IVA）处理后，绘制搏动速率与PKA活性关系图，发现胞质、OMM和MM中均呈现S形曲线相关性。结论：PKA活性与自发搏动速率紧密相关。

**2.8. SANC胞质、MM和OMM中PKA区室化**
在兔SANCs中，基线PKA活性在胞质归一化值为0.48±0.06，MM相似（0.39±0.08），OMM较低（0.21±0.12）。FSK增加所有区室活性，H-89降低活性，且H-89在OMM的作用弱于胞质和MM。结论：SANCs中也存在PKA区室化。

**2.9. Ca²⁺激活的AC是SANCs中PKA活性的重要调节因子**
BAPTA浓度依赖性降低SANCs胞质、OMM和MM中PKA活性（分别降低11%、13.1%、14.7%）。BAPTA与FSK共处理时，胞质活性与单独FSK相似，但OMM和MM活性低于单独FSK；BAPTA与H-89共处理时，MM活性低于单独H-89。结论：Ca²⁺同样调节SANCs中PKA活性及区室化。

**讨论与结论**
**讨论**：本研究发现，抑制Ca²⁺激活的PKA信号导致能量供需失衡，支持第一个假设；PKA活性在胞质和线粒体区室差异分布，且H-89引起区室化效应，支持第二个假设；AC1和AC8表达及搏动速率与PKA活性的S形相关性支持第三个假设；BAPTA减弱H-89的区室化效应，表明Ca²⁺调节PKA区室化；hiPSC-CMs与兔SANCs中PKA动力学和Ca²⁺依赖性调节相似。区室化机制可能涉及AKAP支架蛋白（如AKAP1），但需进一步研究。病理状态下Ca²⁺处理异常和β-肾上腺素能信号重塑可能影响PKA区室动态，为疾病模型提供敏感读数。局限性包括：未使用纯化的SAN样hiPSC-CMs，细胞处于30-60天相对不成熟阶段，可能影响信号组织；pH和探针浓度差异可能影响比较；未进行成熟度分析。

**结论**：PKA活性控制并受膜时钟和Ca²⁺时钟调控。PKA活性在MM和OMM与胞质中呈差异区室化，Ca²⁺在PKA区室化中发挥关键作用。