《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Identification of the GELP Family in Juglans mandshurica Reveals Their Potential Roles in Seed Development and Stress Responses
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GDSL酯酶/脂肪酶（GELPs）是植物生长发育、脂质代谢及胁迫应答的重要调控因子。然而，在具有重要生态和经济价值的木本油料作物物种核桃楸（Juglans mandshurica）中，其基因组特征和表达模式尚未得到系统表征。本研究通过全基因组分析，在核桃楸中鉴
GDSL酯酶/脂肪酶（GELPs）是植物生长发育、脂质代谢及胁迫应答的重要调控因子。然而，在具有重要生态和经济价值的木本油料作物物种核桃楸（Juglans mandshurica）中，其基因组特征和表达模式尚未得到系统表征。本研究通过全基因组分析，在核桃楸中鉴定出61个JmGELP基因。系统发育分析将其划分为七个主要分支，基因结构和保守基序的变异提示潜在的功能分化。启动子顺式作用元件分析显示，响应光、植物激素和非生物胁迫的元件广泛富集。转录组测序和qRT-PCR验证揭示了JmGELP成员具有组织特异性和种子发育阶段特异性表达模式，以及它们对不同胁迫和激素处理的差异性响应。基因本体（GO）注释和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析进一步支持它们在脂质代谢中的作用。转录因子结合位点、miRNA靶标和分子对接的计算机模拟分析预测，JmGELP-3、-38和-41具有不同的转录和转录后调控网络以及潜在的分化底物偏好。本研究首次提供了核桃楸GELP家族的综合表征，鉴定出可能为未来核桃属种质改良和抗逆育种提供参考的候选基因。
**研究背景与问题**
GDSL酯酶/脂肪酶（GELPs）是植物中一个庞大的多基因家族，以保守的Gly-Asp-Ser-Leu（GDSL）基序为特征，广泛存在于真核和原核生物中。GELP家族成员在植物生长发育、脂质代谢以及生物和非生物胁迫应答中发挥关键作用。然而，对于具有重要生态和经济价值的木本油料作物核桃楸（Juglans mandshurica），其GELP家族的系统鉴定与功能研究尚属空白。核桃楸以其耐腐蚀木材和生物活性化合物（如胡桃醌）而闻名，同时具有较强的耐寒、耐旱和耐盐能力，是核桃属经济物种（如核桃）的理想砧木资源。尽管已有高质量基因组序列，但GELP家族在该物种中的组成、表达谱及胁迫相关功能亟待阐明。为此，研究人员开展了本研究，旨在系统鉴定核桃楸GELP基因家族，并初步揭示其在种子发育和胁迫应答中的潜在作用。
**研究内容与结论**
研究人员通过全基因组分析，在核桃楸中鉴定出61个JmGELP基因，并系统表征了其系统发育、染色体分布、基因复制、保守基序、顺式调控元件及理化性质。利用转录组数据分析了不同组织（树皮、叶片、果皮）和种子发育四个阶段（S1–S4）的表达谱，并通过qRT-PCR验证了六个候选基因在盐、干旱、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）处理下的响应。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和基因本体（GO）富集分析支持这些基因参与脂质代谢。通过转录因子（TF）结合位点、miRNA靶标预测和分子对接，进一步分析了三个候选基因（JmGELP-3、-38、-41）的调控网络和底物偏好。研究得出结论：61个JmGELP成员分为七个主要分支，结构和表达分化暗示功能多样性；JmGELP-38和-41与脂质代谢相关，JmGELP-3与防御相关；三个候选基因具有不同的时空表达和胁迫响应模式，可能参与脂质代谢和胁迫适应，但需实验验证。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
**主要关键技术方法**
（1）全基因组BLASTP搜索（E值≤1×10
-5）结合保守结构域（SGNH_plant_lipase_like、GDSL催化三联体）鉴定JmGELP成员；
（2）系统发育分析（最大似然法，JTT+R10模型，1000次超快自举）；
（3）基因复制类型分析（MCScanX）及同线性分析（核桃楸与拟南芥、核桃之间）；
（4）转录组测序（RNA-seq）和差异表达分析（DESeq2，FDR<0.05，|log2FC|≥1）结合qRT-PCR验证；
（5）蛋白质-蛋白质相互作用网络（STRING数据库，组合得分≥0.700）和GO富集分析；
（6）转录因子结合位点预测（PlantRegMap）、miRNA靶标预测（psRNATarget）及分子对接（AutoDock Vina，以棕榈酰辅酶A和10,16-二羟基棕榈酸为配体）。
样本来源：叶片样品采自陕西省西安植物园资源圃（109.03°E, 34.21°N），于2025年8月20日采集。
**研究结果**
**2.1 核桃楸GELP基因家族的鉴定与理化性质表征**
通过比对拟南芥GELP蛋白序列，研究人员在核桃楸基因组中鉴定出61个JmGELP成员，命名为JmGELP-1至JmGELP-61。它们不均匀分布在15条染色体上，其中2号染色体包含最多（9个基因）。理化性质分析显示：蛋白长度338–551个氨基酸，分子量36.6–58.7 kDa；等电点范围4.23–9.37，表明电荷异质性；大多数成员（55个）为稳定蛋白（不稳定指数<40）；62.3%的成员具有负亲水性平均值，呈亲水性；93.44%的成员预测定位于细胞外区域。
**2.2 JmGELP与AtGELP家族的比较系统发育分析**
基于61个JmGELP和100个拟南芥AtGELP蛋白构建的最大似然系统发育树将所有GELP蛋白分为七个单系分支（Clust I–VII）。Clust I和III是最大的分支，分别包含21个和23个JmGELP成员，合计占72%以上；Clust IV–VII仅含11个成员。这种不均匀分布暗示某些分支在核桃楸中经历了谱系特异性扩张。
**2.3 JmGELP蛋白的结构架构**
MEME分析鉴定出10个保守基序，其中基序4、3、8、1对应GELP蛋白的核心催化模块（I、II、III、V），存在于所有61个成员中。结构域注释显示所有成员均属于GDSL/SGNH水解酶超家族。基因结构分析表明大多数成员具有保守的5个外显子和4个内含子结构。
**2.4 JmGELP基因的复制与同线性分析**
基因组复制事件分析显示：全基因组/片段重复（WGD/segmental）和分散重复（DSD）各占34.4%（21个基因），串联重复（TD）占26.2%（16个基因），近端重复（PD）占5.0%（3个基因）。鉴定出8对重复基因，Ka/Ks比值均小于1，表明纯化选择。核桃楸与核桃之间鉴定出69对同线性GELP基因对，Ka/Ks比值中位数为0.285，绝大多数<1，也处于纯化选择。
**2.5 JmGELP基因启动子中的顺式作用元件分析**
61个JmGELP基因的2.0 kb启动子区域富含光响应元件（G-box、Box 4）、植物激素响应元件（茉莉酸甲酯响应CGTCA-motif/TGACG-motif、脱落酸响应ABRE）以及非生物/生物胁迫响应元件（MYB/MYC结合位点、厌氧响应元件ARE等）。每种基因包含的元件数量差异显著。
**2.6 JmGELP基因在不同组织和种子发育过程中的表达谱**
RNA-seq分析显示：26个JmGELP基因在树皮、叶片、果皮三种组织中差异表达；43个基因在种子发育四个阶段（S1–S4）中显著变化。例如，JmGELP-52和-53在树皮中高表达；JmGELP-3和-21在叶片中高表达；种子发育早期（S1/S2）高表达的基因（如JmGELP-16、-22、-41）可能参与胚胎发生，而后期（S3/S4）上调的基因（如JmGELP-13、-38、-48）可能参与种子灌浆和油脂积累。
**2.7 JmGELP基因对非生物胁迫和激素处理的差异性响应**
qRT-PCR验证了六个在叶片中高表达的基因（JmGELP-3、-4、-21、-25、-38、-41）在NaCl（200 mM）、PEG-6000（20% w/v）、SA（100 μM）和MeJA（100 μM）处理24小时后的表达变化。JmGELP-38的诱导最强，PEG处理下上调约8.0倍，SA处理下5.1倍，MeJA处理下3.6倍；JmGELP-21被MeJA（4.1倍）和PEG（3.3倍）显著上调；JmGELP-3和-4被NaCl、PEG和SA适度上调；JmGELP-25被NaCl上调（2.5倍）而MeJA下调（0.4倍）；JmGELP-41被SA（3.6倍）和MeJA（2.2倍）上调，但被NaCl下调（0.7倍）。
**2.8 基于拟南芥直系同源物的JmGELP家族蛋白相互作用网络与功能富集分析**
利用STRING数据库构建的高置信度PPI网络（组合得分≥0.700）中，38个JmGELP成员（62.3%）映射到拟南芥直系同源物，其中8个形成核心相互作用节点。GO富集分析显示网络最显著富集于脂质分解代谢过程（GO:0016042，FDR=1.01×10
-57），92.1%的基因注释到此功能。
**2.9 预测靶向JmGELP成员的转录因子和miRNA**
对三个候选基因（JmGELP-3、-38、-41）的启动子进行TF结合位点预测，共鉴定出41个TF家族。JmGELP-38的启动子富集多重胁迫响应TF（如ERF、WRKY、NAC、MYB）和后期发育TF（如MIKC_MADS、WOX）；JmGELP-41的启动子富含早期发育（如BBR-BPC、ARF、LBD）和防御相关元件；JmGELP-3的结合位点较少，主要为叶片常见元件。miRNA预测显示，JmGELP-38可能被多个miR395家族成员和ath-miR842靶向；JmGELP-41被最多小RNA（包括ath-miR414、ath-miR774b-3p、ath-miR832-3p）靶向；JmGELP-3的预测靶标最少。
**2.10 候选JmGELP基因的分子对接分析**
分子对接分析以棕榈酰辅酶A和10,16-二羟基棕榈酸为配体，预测三个候选蛋白的结合自由能。JmGELP-3与两种底物均能结合，ΔG分别为-6.25 kcal/mol和-5.92 kcal/mol；JmGELP-38与棕榈酰辅酶A的ΔG为-5.94 kcal/mol，与10,16-二羟基棕榈酸的ΔG为-4.60 kcal/mol；JmGELP-41仅与10,16-二羟基棕榈酸形成稳定复合物（ΔG=-5.25 kcal/mol），与棕榈酰辅酶A的ΔG为正值，提示可能无法稳定结合。
**讨论与结论**
讨论部分指出，GELP基因家族在植物脂质代谢和胁迫适应中发挥核心作用，但以往研究多集中于草本模式植物，木本多年生植物信息匮乏。本研究中鉴定出的61个JmGELP成员，其理化性质（如负GRAVY值、93.44%胞外定位）符合分泌型脂肪酶特征。系统发育揭示的分支偏向性扩张可能反映了核桃楸的生态适应。基因复制以WGD和分散重复为主，与苹果、大豆一致，而与水稻、拟南芥的串联重复主导不同。启动子富含光、激素和胁迫响应元件，转录组数据表明许多基因在种子发育早期或晚期特异表达，与油脂积累相关。PPI和GO富集分析支持JmGELP参与脂质分解代谢，分子对接进一步提示可能参与角质和木栓质单体加工。三个候选基因中，JmGELP-38（Clust I，脂质代谢相关）在种子后期高表达、受干旱强烈诱导，其启动子富集ERF和NAC结合位点；JmGELP-41（Clust I）在种子早期高表达，受SA和MeJA诱导，与早期表皮屏障建立相关；JmGELP-3（Clust II，防御相关）主要在叶片表达，对胁迫有温和响应。研究人员强调，这些结论主要基于生物信息学，qRT-PCR仅为单时间点（24小时）数据，且该物种尚无稳定遗传转化体系，因此三个候选基因的功能仍需通过异源表达或基因沉默等实验验证。
**结论部分翻译**
研究人员在核桃楸中鉴定并表征了GELP基因家族。共61个JmGELP成员被划分为七个主要分支。基因结构、启动子顺式元件和表达模式的差异，结合PPI网络证据，暗示家族成员之间存在功能分化，尤其是在脂质代谢和胁迫适应方面。三个候选基因（JmGELP-3、-38和-41）表现出不同的时空表达谱和胁迫响应行为。与JmGELP-3相比，JmGELP-38和JmGELP-41拥有更多的转录因子和miRNA结合位点，并且基于计算机模拟对接分析预测具有不同的底物结合偏好。这些差异表明三个基因可能具有不同的调控机制和功能取向。总的来说，研究结果为核桃楸JmGELP家族提供了基本的基因组和表达资源。这三个候选基因可能代表了未来在核桃楸中研究脂质代谢和胁迫应答的有价值靶点，尽管它们提出的作用仍为假说，需要通过异源表达或基因沉默等方法进行实验验证。
