CXC趋化因子与ORF74受体的混杂结合使免疫毒素方法在γ疱疹病毒模型中可行

《Biochemical Pharmacology》：Promiscuous binding of CXC chemokines to ORF74 receptors enables immunotoxin approaches in Gammaherpesvirus models

　　

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）编码组成型活化的趋化因子受体ORF74，这是病毒发病机制中的关键因子。鼠γ-疱疹病毒68（MHV68）作为KSHV生物学的体内模型，但其ORF74同源物的配体结合和信号传导功能尚未完全了解。为了填补这一知识空白，研究人员通过结合实验和信号测试研究了MHV68-ORF74与人和鼠趋化因子之间的相互作用。此外，研究人员评估了靶向ORF74的人趋化因子为基础的融合毒素蛋白（FTPs）的细胞毒性。研究人员发现MHV68-ORF74以相似的亲和力结合多种人和鼠趋化因子；CXCL10在低纳摩尔范围内显示最高亲和力，并置换CXCL1。尽管缺乏组成型Gi/Gq信号传导，MHV68-ORF74对ELR趋化因子作为激动剂响应，而对CXCL10作为拮抗剂响应，证实了保守的配体依赖性信号传导。该受体表现出强烈的组成型内化，使得FTPs的细胞内递送成为可能。在测试的FTPs中，CXCL10-FTP最有效，特异性杀死表达MHV68-ORF74的细胞，logEC₅₀为-10.00±0.22，比无受体细胞效力高51倍。总之，研究人员确认人趋化因子可以有效靶向MHV68-ORF74，支持在小鼠模型中使用KSHV-ORF74导向的FTPs。然而，MHV68-ORF74与内源性鼠（m）CXCR3的相似敏感性强调了在体内需要mCXCR3敲除系统以实现受体特异性靶向。

论文解读：MHV68-ORF74作为KSHV-ORF74靶向免疫毒素模型的可行性评估

**研究背景与问题**

γ疱疹病毒包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和鼠γ-疱疹病毒68（MHV68），二者均编码病毒G蛋白偶联受体（vGPCR）ORF74。KSHV-ORF74是组成型活化的趋化因子受体，在病毒致病和肿瘤发生中起关键作用。然而，KSHV无法自然感染非人灵长类或啮齿动物，缺乏合适的体内模型。MHV68与KSHV在遗传上密切相关，其ORF74同源物（MHV68-ORF74）在病毒再激活中发挥重要功能，但该受体的配体结合和信号传导特性尚不完全清楚。此前，研究人员已开发出基于人CXC趋化因子的融合毒素蛋白（FTPs），通过靶向KSHV-ORF74的组成型内化选择性杀伤感染细胞，并显示出治疗潜力。为了将这些FTPs策略推进到体内验证，本研究旨在评估MHV68是否可作为KSHV-ORF74靶向FTPs的体内模型，重点考察MHV68-ORF74与人及鼠趋化因子的跨物种兼容性，以及FTPs对其的杀伤效果。该论文发表在《Biochemical Pharmacology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用放射性配体竞争结合实验（使用¹²⁵I-CXCL1和¹²⁵I-CXCL10）测定MHV68-ORF74与多种人鼠CXC趋化因子的结合亲和力；通过磷脂酰肌醇（PI）周转实验和腺苷酸环化酶（cAMP）抑制实验分别评估Gq和Gi信号传导活性；利用扩散增强共振能量转移（DERET）实时内化测定法检测受体组成型内化；使用alamarBlue?试剂进行细胞活力测定评估FTPs的细胞毒性；并采用ColabFold进行结构预测分析CXCL10与受体复合物的相互作用。

**研究结果**

**3.1 人源和鼠源趋化因子与MHV68-ORF74的结合能力相当**
通过放射性配体竞争结合实验，发现MHV68-ORF74可结合多种人鼠CXC趋化因子，亲和力相似。其中，CXCL10在低纳摩尔范围内显示最高亲和力，并能有效置换CXCL1。ELR趋化因子（如CXCL1、CXCL6）和人源非ELR趋化因子（CXCL10、CXCL12）均表现出强结合，而鼠源同源物（mCXCL6、mCXCL10）的亲和力与人类似。病毒趋化因子vCCL2也显示拮抗剂活性。

**3.2 MHV68-ORF74在Gi和Gq信号通路中无组成型活性**
与KSHV-ORF74不同，MHV68-ORF74在对照细胞中不降低cAMP水平（无Gi组成型活性），也不增加PI周转（无Gq组成型活性）。但人源和鼠源ELR CXC趋化因子（如CXCL1、CXCL6、mCXCL1、mCXCL6）可作为激动剂，通过Gi和Gq通路激活信号，且效力相似。非ELR趋化因子（CXCL10、CXCL12、mCXCL10）和vCCL2无激动活性，但能拮抗ELR趋化因子诱导的信号，表明配体依赖性信号传导保守。

**3.3 MHV68-ORF74显示快速组成型内化**
通过DERET实时内化测定，发现MHV68-ORF74在无配体刺激下即表现出强烈的组成型内化，内化速率与KSHV-ORF74相当。添加ELR或非ELR趋化因子（100 nM）未显著改变内化水平，表明内化不依赖配体结合，这为FTP通过内化递送毒素提供了基础。

**3.4 融合毒素蛋白杀伤表达MHV68-ORF74的细胞**
在稳定诱导表达MHV68-ORF74的HEK293细胞中，测试了四种FTPs（CXCL1-FTP、CXCL8-FTP、CXCL10-FTP、CXCL12-FTP）。CXCL10-FTP表现出最高的细胞毒性效力（logEC₅₀ = -10.0±0.2），其对MHV68-ORF74表达细胞的杀伤效力比对照细胞高51倍，而其他FTPs的效力约20倍。CXCL8-FTP效力最低，与其在KSHV-ORF74上的表现一致。

**3.5 针对KSHV-ORF74优化的FTPs对MHV68-ORF74的选择性未改善**
测试了野生型CXCL10-FTP和优化变异体R8D（Arg-8-Asp）对MHV68-ORF74和鼠内源性受体mCXCR3的杀伤。随着四环素诱导的受体表达水平升高，两种FTPs对两种受体的效力均增强，但野生型CXCL10-FTP对MHV68-ORF74和mCXCR3的效力相似，选择性差。R8D变异体虽显示一定选择性迹象，但以降低总效力为代价。结构预测表明，CXCL10的R8残基与MHV68-ORF74的结合口袋中，关键残基N293（在KSHV-ORF74中）被A292取代，可能削弱了相互作用，导致选择性降低。

**讨论与结论**

研究人员总结，MHV68-ORF74在配体结合、配体依赖性信号传导和组成型内化方面与KSHV-ORF74高度相似，支持MHV68作为评估靶向ORF74的FTPs的相关体内模型。然而，CXCL10-FTP对MHV68-ORF74和mCXCR3的相似敏感性表明，在体内应用中需要mCXCR3敲除系统以实现受体特异性靶向。研究结论强调，人趋化因子可有效靶向MHV68-ORF74，人鼠趋化因子在ORF74上的结合和信号传导具有跨物种兼容性，但优化FTP选择性时需考虑与内源性受体的交叉反应。未来研究应使用mCXCR3敲除小鼠模型，以精确评估FTPs对病毒受体表达细胞的选择性杀伤效果。