纳米制剂中残留溶剂杂质的气相色谱定量方法

《Methods and Protocols》：Gas Chromatography Method for Quantitation of Residual Solvent Impurities in Nanoformulations

　　

研究人员描述了一种用于评估纳米医学制剂中常用19种第2类和第3类残留溶剂的灵敏、快速且特异的气相色谱法（Gas Chromatography, GC）的开发和验证。方法验证采用PerkinElmer的头空气相色谱系统（Headspace Gas Chromatography, HS-GC），配备火焰离子化检测器（Flame Ionization Detection, FID）和Elite 624 Crossbond 6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷或DB-Fatwax-超惰性色谱柱，以氦气为载气。评估了线性、加标回收率、方法精密度、特异性、灵敏度、检测限/定量限（Limit of Detection/Quantitation, LOD/LOQ）和分析物稳定性等验证特性。验证方法显示出优异线性，相关系数>0.99，且对所有测试分析物的日间精密度<7.4%。在方法定量范围内，回收率范围为83–104%。与先前报道的方法相比，本方法具有更短的平衡时间、更高的灵敏度、对多种溶剂更佳的分离效果以及更宽的浓度检测范围。本方法同样完全适用于分析短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acids, SCFAs），如甲酸、乙酸、丁酸和戊酸，无需额外的提取或衍生化步骤。值得注意的是，该方法适用于分析甲酸（某些纳米制剂中的常见溶剂，且此前尚无不需要额外样品处理的气相色谱法可用），检测限低至约75 ppm。本文通过多种纳米制剂（包括商业Doxil制剂以及若干研究用纳米制剂，如聚合物、交联聚合物和树枝状大分子平台）展示了该方法的应用。

**论文解读：纳米制剂中残留溶剂杂质的气相色谱定量方法**

**研究背景**

在纳米药物（如纳米医学制剂）的合成、制造和纯化过程中，广泛使用多种有机溶剂。这些溶剂也用于清洗和维护生产设备。残留溶剂（Residual Solvents, RS）作为药物杂质，不提供治疗益处，其浓度不当不仅危及患者健康，还会影响产品质量和纳米治疗剂的理化性质（如粒径、溶解性、润湿性和药物负载/释放）。因此，对残留挥发性杂质的检测和定量是质量控制的关键，以确保药物产品符合药典要求，保障患者安全。国际协调会议（International Council for Harmonization, ICH）和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）发布了残留溶剂分类指南（Q3C(R9)），将溶剂分为三类：第1类具有不可接受的毒性，应避免使用（限度<10 ppm）；第2类为非遗传毒性致癌物，使用受限（每类溶剂有各自的ICH限度，基于允许日暴露量（Permitted Daily Exposure, PDE）范围为50–3880 ppm）；第3类毒性较低，通常允许限度为5000 ppm或0.5%（w/w）。

目前，残留溶剂的定量方法包括失重法、红外光谱、核磁共振波谱、热重分析、差示扫描量热法，以及最常用的气相色谱法（Gas Chromatography, GC）。GC已成为首选技术，但现有方法存在灵敏度低、特异性差或样品要求高等问题。头空气相色谱法（Headspace Gas Chromatography, HS-GC）通过引入挥发性组分，延长了色谱柱寿命并减少了仪器维护。然而，现有HS-GC方法或无法广泛分析低挥发性残留溶剂（如甲酸及其他短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acids, SCFAs）），或缺乏整体灵敏度。对SCFAs的分析通常需要液-液萃取、盐析或衍生化等额外步骤，这些步骤耗时且可能影响定量准确性。纳米制剂因其超小粒径、复杂基质和高表面积，对残留溶剂分析提出了独特挑战，如强溶剂截留和基质干扰。因此，有必要开发一种标准、广泛适用的GC方法，用于纳米制剂中常见残留挥发性有机溶剂和SCFAs的检测与定量。

**研究目的与结论**

本研究旨在开发并验证一种可作为标准测试方法的GC程序，用于检测和定量纳米技术药物产品中可能存在的常见挥发性有机溶剂。研究人员根据ICH和FDA指南，使用PerkinElmer HS自动进样器、Clarus 690 GC（配备FID）和SQ8T质谱仪，对19种最常用的第2类和第3类溶剂及SCFAs进行了方法验证。验证结果表明，该方法具有优异的线性（相关系数>0.99）、良好的精密度（日间精密度<7.4%）、准确的回收率（83–104%），以及更短的平衡时间、更高的灵敏度和更宽的浓度检测范围。该方法特别适用于甲酸等SCFAs的分析，无需衍生化，甲酸的定量限（Limit of Quantitation, LOQ）低至75 ppm。通过商业化Doxil制剂和多种研究用纳米制剂（聚合物、交联聚合物和树枝状大分子平台）的应用，证明了方法的实用性。该论文发表在《Methods and Protocols》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用PerkinElmer Turbomatrix HS-40 Trap头空气相色谱自动进样器（HST40）与Clarus 690 GC（配备FID和Clarus SQ8 MS电子电离质谱仪）联用。对于高挥发性残留溶剂，使用Elite-624 Crossbond 6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷毛细管柱（0.32 mm ID × 30 m, 1.8 μm膜厚）或Elite-1 100%二甲基聚硅氧烷柱（0.32 mm ID × 30 m, 1.8 μm膜厚）比较分离效率；对于SCFAs，使用DB-Fatwax超惰性色谱柱（0.25 mm ID × 30 m, 0.25 μm膜厚）。载气为氦气。样品稀释剂选择：高挥发性溶剂用二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO），低挥发性溶剂和SCFAs用甲醇。方法验证包括线性、加标回收率、精密度、特异性、灵敏度、检测限（LOD）和定量限（LOQ）及分析物稳定性。样本来源：商业化Doxil（Baxter International, Inc.）购自NIH药房；空脂质体（无药物负载）来自FormuMax Scientific, Inc.；聚合物纳米制剂（TNM）由Tel Aviv大学Ronit Satchi-Fainaro教授和Lisbon大学Helena Florindo教授提供；交联聚合物制剂（CLP）由Privo Technologies提供；树枝状大分子纳米缀合物（DM）由Nebraska医学中心Chi Zhang教授提供。

**研究结果**

**3.1 分析方法优化**
通过比较不同稀释剂和色谱柱，确定DMSO为高挥发性残留溶剂的稀释剂（因其低毒性和高溶解能力），甲醇为SCFAs和低挥发性溶剂的稀释剂。HS平衡条件优化为120°C、8分钟。对于高挥发性溶剂，6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷柱（G43相）优于100%二甲基聚硅氧烷柱（G2相），能实现更好的分离。对于SCFAs，DB-Fatwax超惰性柱可有效分离甲酸、乙酸、丁酸和戊酸，无需衍生化。

**3.2 方法验证**

**3.2.1 线性**
所有分析物在LOQ至150% ICH限度范围内呈现良好线性，回归系数（r2）为0.9958–0.9998。

**3.2.2 检测限（LOD）和定量限（LOQ）**
基于信噪比3:1和10:1确定LOD和LOQ。甲酸的LOQ为75 ppm，且无需衍生化。

**3.2.3 特异性和灵敏度**
空白和空白脂质体基质对分析物保留时间无干扰。与先前研究相比，本方法对19种分析物中的17种具有更高灵敏度。

**3.2.4 准确度和回收率**
在PLOQ、50%和150% ICH限度水平进行加标回收实验，回收率为83.3–104.1%，偏差在±7.4%以内（PLOQ水平为±16.7%），符合ICH标准（80–120%）。

**3.2.5 方法精密度、系统精密度和系统适用性**
日间精密度（%RSD）为0.6–7.4%（n=6），系统精密度（%RSD）≤4.1%（除戊酸为7.4%）。检查标准和括号标准回收率为98–104%。

**3.2.6 分析物稳定性**
样品在室温下24小时和48小时后的浓度偏差分别为≤7.7%和≤9.8%。

**3.3 测试纳米制剂中挥发性杂质的分析**
- **Doxil（脂质体制剂）**：检测到乙醇残留，浓度为43 ppm（%RSD=5.2）。
- **TNM（聚合物纳米制剂）**：未检测到二氯甲烷（低于0.001%），但意外检出乙醇（84 ppm）和痕量丙酮（低于LOQ）。
- **CLP（交联聚合物制剂）**：检测到乙酸残留（3241 ppm），以及稀释剂成分丙二醇。
- **DM（树枝状大分子纳米缀合物）**：检测到DMSO残留（7040 ppm），超过ICH限度（5000 ppm），表明需要改进溶剂去除工艺。

**讨论与结论**

讨论部分指出，残留溶剂的检测和定量对纳米药物至关重要，因其影响理化性质和生物效应。研究优化了低沸点和高沸点溶剂的分离条件，并验证了方法的适用性。与先前方法相比，本方法具有更短的平衡时间、更高的灵敏度，且对SCFAs（包括甲酸）无需衍生化，显著提高了定量准确性。方法在四种纳米制剂中成功应用，展示了其广泛适用性，能检测出预期和非预期的残留溶剂，为批次放行测试提供了有价值的工具。

**结论部分翻译**：
本研究中描述的气相色谱法（GC）根据ICH指南进行了验证，用于检测和定量19种常见挥发性有机溶剂和短链脂肪酸（SCFAs）。该方法被证明灵敏、线性、特异、准确、稳定且精确。描述了选择色谱柱、稀释剂和其他HS参数的依据，与先前发表的方法相比，本方法具有更宽的检测范围、更短的HS平衡时间和更高的灵敏度。高灵敏度使该方法不仅适用于分析已知工艺杂质，还适用于分析来自操作步骤、玻璃器皿和仪器清洗等可能存在的其他常见杂质。该方法还适用于SCFAs（包括甲酸）的定量分析，无需额外的提取或衍生化步骤——这是一个重要区别，因为额外的样品处理步骤和提取/衍生化效率会影响定量准确性。总体而言，该方法是一种简单且广泛适用的方法，适用于高通量分析原料药、聚合物及聚合物-药物缀合物、脂质、树枝状大分子以及用于纳米医学制剂生产的其他物种中常见的残留挥发性杂质。