外周血DNA甲基化部分反映额叶脑内免疫细胞类型组成

《Brain, Behavior, & Immunity - Health》：Peripheral blood DNA methylation partially reports on immune cell type composition in the frontal brain

　　

大多数现有的DNA甲基化(DNA methylation, DNAm)研究使用外周替代组织来研究脑部疾病和障碍背后的分子机制。最初比较脑与血液的研究主要在单个CpG位点水平进行分析，通常指出表观遗传模式的重叠有限，这与DNAm在很大程度上具有组织和甚至细胞类型特异性相一致。在这些研究的基础上，研究人员采用了更复杂的分析策略，旨在：1）在额叶脑和外周血中识别与解卷积估计的脑细胞类型比例（本研究的主要测量指标）相关的单个DNAm位点；2）通过多变量模型结合血液DNAm位点来预测脑细胞类型比例；3）检查血液DNAm、年龄和表观遗传年龄加速(Epigenetic Age Acceleration, EAA)对脑细胞类型比例的影响。对匹配的额叶脑和外周血样本（n=104）中七种脑细胞类型比例进行的表观基因组关联研究(Epigenome-Wide Association Studies, EWAS)显示，约10%的脑细胞类型相关DNAm位点在外周血中具有相关的DNAm水平（p<0.05）。然而，仅有三个外周血DNAm位点与内皮细胞和基质脑细胞类型比例显著相关（校正后p<0.05）。使用外周血DNAm通过机器学习方法训练的脑细胞类型比例预测，与利用脑DNAm通过细胞解卷积估计的小胶质细胞比例显示出最强但仍适度的相关性。此外，解卷积估计的血液免疫细胞类型比例显示与估计的脑基质细胞比例存在名义上的显著关联，主要由自然杀伤(Natural Killer, NK)细胞驱动；然而，这种关联依赖于实际年龄(Chronological Age)，并且在年龄残差化后未能保持显著性。最后，脑EAA与脑和血细胞类型比例无关（校正后p<0.05）。总之，这些结果表明，在DNAm模式广泛的组织特异性背景下，外周血中的DNAm水平实际上可能提供一些免疫细胞类型比例的信息。血液和组织特异性免疫细胞类型的DNAm谱之间的相关性，与外周免疫与中枢神经系统免疫功能之间的潜在联系相一致。

该研究发表于《Brain, Behavior, 》。研究背景方面，脑部相关疾病如精神疾病、神经退行性疾病患病率高且发病机制复杂，涉及遗传与环境多因素交互，现有治疗手段有限。脑细胞类型比例及功能的改变被发现与多种脑疾病密切相关，例如小胶质细胞、星形胶质细胞及神经元在不同疾病中均显示出比例与基因表达异常。由于活体获取人脑组织的极大局限性，现有DNA甲基化(DNA methylation, DNAm)关联研究多依赖外周血等替代组织。然而DNAm具有高度的组织与细胞类型特异性，既往研究表明脑与血液间单个CpG位点的DNAm相关性仅约6%至11%，这给基于血液DNAm推断脑内表观遗传及细胞组成带来了根本性的解释难题。尽管存在组织特异性，脑血系统间存在免疫交叉对话及物理相互作用，且多种脑病与自身免疫疾病共患率高，提示外周免疫与中枢免疫细胞可能存在共享的分子调控线索。同时，年龄作为脑病核心风险因子与免疫衰退及表观遗传年龄加速(Epigenetic Age Acceleration, EAA)紧密相关，需在研究中厘清其影响。因此，研究人员开展此项研究，旨在系统探究外周血DNAm是否在复杂分析层面能反映额叶脑的细胞类型组成，特别是免疫相关细胞类型，并评估年龄因素的作用，以期为难以获取的脑样本提供潜在的血液生物标志物解读依据。

作者为开展研究用到几个主要关键的技术方法包括：整合四个公开数据集（GSE214901、GSE95049、GSE111165、GSE59685）共104例配对的额叶脑与外周血样本；使用Illumina HumanMethylation450 BeadChip（450K array）及Infinium MethylationEPIC BeadChip（EPIC array）进行DNAm检测并保留重叠探针；采用HiBED（Hierarchical Brain Extended Deconvolution）v0.99.6 R包进行脑七种细胞类型（星形胶质细胞、内皮细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、基质细胞）比例表观基因组解卷积估计，采用IDOL扩展参考集基于约束投影法估计血液十二种免疫细胞类型比例；开展表观基因组关联研究(meta-EWAS)，使用METAL进行样本量加权荟萃分析并采用Benjamini-Hochberg法校正；构建Ridge回归与Random Forest（RF）机器学习多变量模型预测脑细胞比例；利用RAMEN包生成可变甲基化区域(Variable Methylated Regions, VMRs)降维；采用Cortical Clock计算皮质表观遗传年龄及EAA；进行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)及置换检验等统计分析。

研究结果部分保留小标题说明如下。3.1 Dataset description研究人员整合四个公开数据集获得104例配对额叶脑与血样本，中位年龄76.76岁，44%为男性，首先用HiBED解卷积估计七种脑细胞比例，其中少突胶质细胞占比最高（均值38.15%），谷氨酸能神经元次之（均值25.72%），二者因组成数据特性呈强负相关（Pearson’s r = -0.91, p < 2.2 * 10^-16），各数据集活体与尸检组织细胞比例分布相似，以此作为后续分析基础。3.2 DNA methylation associations with brain cell type proportions were tissue-specific在脑组织中meta-EWAS发现与少突胶质细胞相关的显著DNAm位点最多（54,425个），谷氨酸能神经元36,217个，小胶质细胞8,391个等，约77% GABA能神经元相关位点为正相关，星形胶质细胞等多为负相关，且少突与谷氨酸能神经元位点重叠度高；约10%的脑相关DNAm位点在血中有显著血脑相关（p<0.05，校正后2.79%），而在外周血EWAS中仅识别到3个显著位点（2个内皮、1个基质细胞，校正后p<0.05），其余五种脑细胞无显著血DNAm关联，血与脑单站点效应量一致性低。3.3 Predicted brain cell type proportions in peripheral blood showed the strongest correlation with deconvolution-estimated immune brain cell types使用Ridge回归基于血DNAm预测脑细胞比例，测试集显示预测值与解卷积估计的小胶质细胞比例呈名义显著相关（Pearson’s r = 0.525, 未校正p=0.0366），其余细胞类型预测误差较大，内皮与基质细胞预测比例趋零；引入可变甲基化区域(VMRs)及Random Forest模型仍未改善性能，但用脑DNAm自身预测脑免疫细胞类型则表现良好，说明全血DNAm对多数脑细胞类型信息有限。3.4 DNA methylation sites used in epigenomic cell deconvolution predicted brain cell types based on brain and blood data选取脑解卷积参考板中429个在血脑共有的位点，其中48个在血脑间显著相关（Pearson’s r范围|0.198-0.537|）；脑中这些位点的第一主成分(PC1)解释98%-100%方差且与对应脑细胞比例显著相关（r|0.571-0.969|）；血中同源PC1与内皮细胞（r=0.400）、小胶质细胞（r=0.247）、基质细胞（r=0.341）比例显著相关，印证血DNAm对脑免疫相关细胞具一定指示性。3.5 Correlations between blood immune cell types and brain cell type proportions were dependent on chronological age血免疫细胞解卷积显示NK细胞与脑基质细胞呈名义负相关性（r=0.334, 校正后p=0.044），但在将细胞比例对实际年龄残差化后，所有血脑细胞类型相关性消失（校正后p>0.05），表明该关联受年龄混杂影响。3.6 Biological brain ageing was not correlated with brain or blood cell type proportions用Cortical Clock计算皮质EAA并剔除一例异常值（EAA=50）后，发现皮质EAA与任何脑及血细胞类型比例均无显著关联（校正后p<0.05）。

讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，脑组织中识别到的大量细胞类型相关DNAm位点符合预期，且关联方向与既往报道一致（如GABA能神经元高甲基化、胶质细胞低甲基化及小胶质细胞髓系起源低甲基化特征）；血中存在极少数与脑内皮、基质相关的显著位点，可能与HiBED中内皮基质参考源于新生儿脐带血共享发育起源有关。多变量及PCA均提示血DNAm对脑免疫类细胞（小胶质、内皮、基质）具一定预测力，反映外周与中枢免疫潜在联系，可为难以采样的脑免疫研究提供线索，但需注意解卷积本身的噪声。血NK与脑基质负关联在年龄校正后不显著，需大样本验证及功能实验。脑EAA与细胞比例无关联，不同于外周血中NK等与表观衰老的关联报道。研究局限性包括混合活体与尸检组织、部分血样与脑样采集间隔中位2年、训练样本量较小（N=104）、仅限额叶脑区、年龄跨度大及450K/EPIC阵列无法区分DNA羟甲基化(DNA hydroxymethylation, DNAhm)等。最后翻译结论部分：总之，通过DNAm的视角，此处呈现的结果支持了先前发现外周血与脑（特别是在免疫系统）存在重叠的研究。研究人员表明外周DNAm可为免疫脑细胞类型比例估计提供信息。鉴于现存的外周血与脑DNAm相关性，使用外周血中稳定的细胞身份测量即DNAm作为某些脑细胞类型比例的生物标志物可能是合理的。总而言之，这些结果和建议可为脑相关结局背景下源自外周血的DNAm关联解释增添内容。