新生儿接触丙泊酚会在小鼠大脑皮层和海马体中引发区域特异性的神经毒性蛋白质组特征

《Brain Research》：Neonatal propofol exposure induces region-specific neurotoxic proteomic signatures in mouse cortex and hippocampus

　　

摘要

新生儿接触丙泊酚可能与长期神经发育障碍有关，但具体的区域特异性分子机制尚未明确。本研究探讨了新生儿接触丙泊酚后，大脑皮层和海马体中富集外泌体的小型细胞外囊泡所出现的区域特异性蛋白质组变化。研究采用与临床相关的重复给药方案，让C57BL/6小鼠在出生后第5至7天接受丙泊酚治疗（剂量为50毫克/千克）。在出生后第21天，分离出富集外泌体的小型细胞外囊泡，并通过数据独立采集质谱技术对其进行分析。通过倍数变化值≥1.5或≤0.667且p值小于0.05的标准筛选出差异表达蛋白候选物，随后进一步通过基因本体论、KEGG通路、同源群分类以及结构域富集分析对这些蛋白进行研究。经过Benjamini-Hochberg校正后，没有蛋白的q值低于0.05，说明这些初步发现并不具有显著性。我们在海马体中发现了63种差异表达蛋白候选物，在大脑皮层中发现了55种。海马体中下调的蛋白多与突触囊泡循环、氧化磷酸化及细胞凋亡相关，表明存在突触和线粒体功能紊乱；而上调的蛋白则与内质网应激及分子伴侣介导的自噬有关，暗示机体正在尝试通过蛋白质稳态调节来应对损伤。大脑皮层中的差异表达蛋白则反映出线粒体功能受损，同时翻译活动和细胞骨架重构有所增强。这些区域及方向特异性的变化在所有生物信息学分析中均得到一致验证。海马体表现出明显的突触和线粒体功能改变，而大脑皮层则出现细胞骨架变化及代谢紊乱。总之，丙泊酚会在新生动物的大脑海马体和皮层中引发不同的神经毒性蛋白质组变化，这说明不同脑区存在特定的易感性以及相应的代偿性重构机制。因此，利用富集外泌体的小型细胞外囊泡进行蛋白质组分析，是一种检测麻醉剂引发的早期神经发育异常的敏感方法。

引言

由于全身麻醉剂可能对大脑发育造成长期影响，新生儿接触这类药物已成为儿科医学领域日益受关注的课题（Davidson和Sun，2018；Sanders等人，2013；Vutskits和Xie，2016）。丙泊酚因其起效快、恢复时间短而被广泛使用，但有研究表明，新生儿期接触该药物可能导致日后出现持续的认知、行为及情绪方面的缺陷（Briner等人，2010；Cattano等人，2008；Vutskits和Xie，2016；Yang等人，2022）。啮齿类动物和灵长类动物的研究显示，丙泊酚会在大脑发育的关键时期引发广泛的神经毒性作用，包括神经元凋亡、突触丢失、线粒体功能障碍以及氧化应激（Bosnjak等人，2016）。

富集外泌体的小型细胞外囊泡是由神经元和胶质细胞分泌的纳米级囊泡（尺寸在30–150纳米之间），它们通过携带特定的物质——如突触相关蛋白或线粒体蛋白——来介导细胞间通信，同时也能反映细胞的早期应激状态，因此在神经发育过程中起着重要作用（Théry等人，2018；You和Ikezu，2019）。在突触形成过程中，这类囊泡能够调控突触的构建以及线粒体代谢，因此其携带的蛋白对于理解发育过程中的异常变化具有重要意义（Sharma等人，2019）。与普通组织蛋白质组分析相比，富集外泌体的小型细胞外囊泡蛋白质组分析能够捕捉到具有功能活性、能响应应激的蛋白，且不会掩盖不同细胞类型的特征信号，因而更有利于检测细微的区域特异性变化（Dingledine等人，2014；L?tvall等人，2014）。

虽然麻醉剂暴露所带来的行为及组织病理学变化已有较多研究报道（Jevtovic-Todorovic等人，2003；Paule等人，2011），但针对新生儿大脑各亚区域的蛋白质组研究仍然相对较少。大脑皮层和海马体是学习、记忆以及感觉运动整合功能的重要中枢（Kolb和Whishaw，1998；Lavenex和Banta Lavenex，2013；Rakic，2009），它们对麻醉剂的反应可能存在差异。此外，以往的研究多采用整个大脑组织或粗略的裂解液样本，这可能会掩盖不同细胞类型及特定区域的信息（Fischer和Maier，2015）。

我们推测，新生儿接触丙泊酚会导致海马体和大脑皮层中的小型细胞外囊泡出现区域特异性的蛋白质组变化，进而以区域特异性的方式干扰神经发育过程。为了验证这一假设，我们在小鼠出生后第21天——即多次给予丙泊酚治疗之后——从大脑皮层和海马体中分离出富集外泌体的小型细胞外囊泡，并使用数据独立采集质谱技术对其进行分析。随后通过多种功能富集分析方法，包括基因本体论分析、KEGG通路分析、同源群分类分析以及蛋白结构域分析，来揭示这些变化背后的生物学意义。这一研究旨在识别早期出现的区域特异性分子变化以及受影响的信号通路，从而为了解新生儿接触丙泊酚后的神经发育后果提供依据。

章节节选

动物模型与丙泊酚暴露处理

本研究使用的新生C57BL/6小鼠为SPF级，性别不限，由北京维塔河实验动物科技有限公司提供。这些小鼠与母鼠一同饲养在符合标准条件的环境里（温度为22±1摄氏度，光照周期为12小时亮/12小时暗，可随时获取食物和水），实验动物设施已获得机构动物护理和使用委员会的批准。

在小鼠出生后第5天，它们被随机分为两组：一组接受丙泊酚处理，另一组作为对照组。

富集外泌体的小型细胞外囊泡的特征分析

图1展示了整个实验设计的概要以及分析流程。为了研究丙泊酚在发育中的大脑中引发的早期、区域特异性的分子变化，我们对从新生小鼠的海马体和大脑皮层中分离出的富集外泌体的小型细胞外囊泡进行了蛋白质组分析。与普通大脑组织相比，这种富集外泌体的小型细胞外囊泡分析方法更具敏感性，也能捕捉到更具功能意义的蛋白变化。

讨论

本研究表明，新生儿接触丙泊酚会导致从小鼠海马体和大脑皮层中分离出的富集外泌体的小型细胞外囊泡出现不同的区域特异性蛋白质组特征。通过多维度生物信息学分析方法——包括基因本体论分析、KEGG通路分析、同源群分类分析以及结构域富集分析——我们发现了丙泊酚引发的两种不同的致病机制：在海马体中表现为严重的突触和线粒体损伤，而在大脑皮层中则表现为细胞骨架和翻译功能的适应性重构。

结论

本研究发现了新生儿接触丙泊酚后，海马体及大脑皮层组织中富集外泌体的小型细胞外囊泡所出现的区域特异性蛋白质组变化。根据设定的筛选标准——倍数变化值≥1.5或≤0.667，且p值小于0.05——我们在海马体中找到了63种差异表达蛋白候选物，在大脑皮层中找到了55种。海马体中既有核心突触相关蛋白STX1B的丢失，也有线粒体相关蛋白CY1的减少；而大脑皮层则呈现出应激适应特征：线粒体VDAC2/3蛋白的表达水平下降。

作者贡献声明

陈留荣：负责原文撰写、软件应用、研究方法设计、实验实施、正式数据分析以及数据整理工作。王慧梅：同样参与原文撰写、软件应用、研究方法设计、实验实施、正式数据分析以及数据整理工作。黄慧芳：负责文章审阅与编辑、实验实施以及数据整理工作。林英川：参与文章审阅与编辑、研究方法设计、实验实施以及正式数据分析工作。高海英：负责文章审阅与编辑、结果验证、研究监督、资源协调、项目管理以及实验实施工作。

伦理审批情况

本研究遵循ARRIVE指南开展。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院发布的《实验室动物护理和使用指南》执行，并已获得厦门大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号为XMULA20180026）。

资金支持

本研究得到了中国福建省自然科学基金（项目编号2022J011376）、厦门市医疗卫生引导项目（项目编号3502Z20214ZD1029）以及转化医学研究孵化基金项目（项目编号XFY2020008）的支持。

未引用参考文献

Chen等人，2022年；Ma等人，2019年。

利益冲突声明

所有作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

无。

陈留荣|王慧梅|黄慧芳|林英川|高海英

中国厦门市361003，厦门大学医学院，厦门大学第一附属医院麻醉科