GADD45A在脊髓损伤后通过NF-κB信号通路协同调控神经元铁死亡与凋亡中的新作用

《Cellular Signalling》：Novel role of GADD45A in synergistic regulation of neuronal ferroptosis and apoptosis after spinal cord injury via NF-κB signaling

　　

摘要

在脊髓损伤后，铁死亡与细胞凋亡是导致神经元损伤的主要机制，但协调这两种过程的调控因子目前仍不明确。在本研究中，我们分析了脊髓损伤后7天内的188个与铁死亡相关的差异表达基因，确定GADD45A是脊髓损伤后铁死亡途径中的核心基因，其功能特征与细胞凋亡密切相关。在受损的脊髓组织中，GADD45A的表达显著升高。在体内实验中，敲低GADD45A可通过调节铁死亡和细胞凋亡相关标志物，改善神经功能恢复并促进组织修复。在经H₂O₂处理的PC12细胞中，敲低GADD45A可降低Cleaved Caspase-3、BAX、Cleaved Caspase-9、4-HNE及ACSL4的表达，同时增加BCL-2、GPX4、FTH1和FPN的表达，还能减轻H₂O₂引起的细胞损伤。从机制上来看，敲低GADD45A可抑制NF-κB信号通路，减少NF-κB-p65向细胞核的转移。这些保护作用可被NF-κB激活剂CU-T12–9所逆转。总体而言，这些研究结果表明GADD45A通过调控NF-κB通路促进脊髓损伤后的神经元铁死亡和细胞凋亡，因此可能成为治疗脊髓损伤的潜在靶点。

引言

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，会导致较高的残疾率和死亡率[1]。它会造成感觉、运动和自主功能障碍，严重影响患者的生活质量[2]。脊髓损伤的病理过程通常分为原发损伤和继发损伤。原发损伤直接由机械性创伤和脊髓组织结构破坏引起[3]，而继发损伤则是由一系列持续数周或数月的病理反应逐步发展而来，其造成的损害往往比初始损伤更为严重[4]。这一继发阶段的特点包括氧化应激、炎症反应、铁死亡、细胞凋亡等其他病理过程[5]。由于目前尚无有效方法能够逆转原发损伤，研究重点逐渐转向限制继发损伤以改善神经功能恢复。在此背景下，寻找有效的治疗靶点具有重要的临床意义[6]。

细胞凋亡是一种保守的程序性细胞死亡形式，能在正常状态下维持组织平衡[7]。然而在脊髓损伤后，这一过程会出现异常，许多神经元会在数小时内发生细胞凋亡，进而导致运动和感觉功能受损[8]。在线粒体细胞凋亡途径的关键调控因子中，B细胞淋巴瘤2蛋白（BCL-2）和BCL-2相关X蛋白（BAX）起着核心作用，二者之间的失衡是导致神经元丢失的重要原因[9]。

铁死亡是一种依赖铁元素的调控性细胞死亡形式，其与细胞凋亡在生物学特征上存在差异，其特点是铁元素过量、活性氧积累过多以及脂质过氧化加剧[10]。自2012年这一概念被提出以来，越来越多的证据表明抑制铁死亡能够减少脊髓组织的继发性损伤，有助于脊髓损伤后的神经功能恢复[11]。在细胞层面，发生铁死亡的细胞通常会出现线粒体萎缩以及正常的线粒体嵴结构消失的情况[12]。从机制上看，铁死亡与谷胱甘肽过氧化物酶4活性下降导致的抗氧化防御能力减弱，以及铁代谢相关蛋白表达异常引发的铁平衡紊乱密切相关。这些变化最终会导致活性氧和脂质过氧化物的积累，进而引发细胞功能障碍和死亡[13]。

NF-κB是一条重要的信号通路，可调控中枢神经系统中的炎症反应和细胞死亡过程。脊髓损伤发生后，NF-κB-p65会进入细胞核，从而持续激活该信号通路[14]。这种激活会促使肿瘤坏死因子和白细胞介素等促炎细胞因子的产生和释放增加，进一步加剧炎症反应，加重继发损伤[15]。NF-κB还会参与铁死亡、细胞凋亡及其他形式的细胞死亡过程，进而影响神经元和胶质细胞的存活及其功能恢复。正因如此，NF-κB通路在脊髓损伤的进展过程中起着重要作用，可能成为治疗的潜在靶点。

先前的研究表明，脊髓损伤后生长停滞和DNA损伤诱导因子α（GADD45A）的mRNA水平会显著上升，但其蛋白质表达模式以及在脊髓损伤中的具体生物学功能仍未明确[16]。在脑缺血再灌注损伤模型中，沉默GADD45A已被证明可以抑制FOXO1信号通路，减轻组织损伤[17]。因此，本研究旨在探讨GADD45A在脊髓损伤后神经元铁死亡和细胞凋亡过程中的潜在作用，为进一步理解脊髓损伤的发病机制提供实验依据。

章节节选

数据来源与基因集筛选

基因表达谱数据来源于基因表达组数据库中的GSE45006数据集（GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），该数据集基于GPL1355 [Rat230_2]版本的Affymetrix大鼠230 2.0基因芯片，包含了不同时间点的完整脊髓组织样本和受损脊髓组织样本[18]。与铁死亡相关的基因集则从GeneCards数据库中获取并下载（https://www.genecards.org）。

差异基因表达分析

对GSE45006数据集进行了差异表达分析

差异表达基因的筛选与鉴定

本研究使用了GSE45006基因表达数据集，其中包含在损伤诱导后1天、3天、7天和14天收集的16份脊髓损伤模型样本（每个时间点4份）以及4份正常对照样本。针对7天组的数据，我们以调整后的P值小于0.05且|logFC|大于1作为筛选标准，进行了差异表达分析。该分析共鉴定出1251个上调基因和1046个下调基因，相关结果展示在热图（图1A）和火山图中

讨论

脊髓损伤是一种极为严重的中枢神经系统创伤性疾病，其病理进展涉及多种病理生理机制的复杂协同作用。由于单一靶点干预往往难以有效阻止脊髓损伤后的级联损伤反应，多靶点联合疗法已成为当前脊髓损伤治疗领域的主要研究方向[28]。神经元的铁死亡和细胞凋亡是脊髓损伤过程中的关键病理机制

CRediT作者贡献声明

罗志超：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、研究监督、软件应用、项目管理、方法设计、正式分析、数据整理、概念构建。余浩：验证工作、软件应用。陈鹏：项目管理、方法设计。郝琳：软件应用、项目管理。洪庆武：验证工作、方法设计。宣勇：资源筹备、资金获取。尹宗生：验证工作、资源筹备、实验研究、资金获取。

出版许可

无需许可。

伦理审批与受试者同意

本研究涉及的动物实验方案已获得安徽医科大学伦理委员会的批准（批准编号：LLSC20231047）。

资金支持

本研究得到了国家自然科学基金的资助（编号：8237092261）。

利益冲突声明

作者声明，本研究的开展过程中不存在任何可能被视为利益冲突的商业或财务关系。

Zhichao Luo|Hao Yu|Peng Chen|Lin Hao|W.U. Hongqing|Yong Xuan|Zongsheng Yin

安徽医科大学第一附属医院骨科，中国合肥绩溪路218号，邮编230022