综述：Tribbles假激酶：精细调控细胞信号及其在代谢、炎症和癌症中的意义

《Current Opinion in Cell Biology》：Tribbles pseudokinases: Fine tuning of cell signaling with implications in metabolism, inflammation and cancer

　　

在蛋白激酶家族中，存在一个“人类全激酶组进化相关成员”亚群，它们缺乏（或仅有极有限的）酶活性。这些蛋白质，即所谓的假激酶（pseudokinases），凭借其建立调控性蛋白质-蛋白质相互作用的能力发挥重要功能。具体而言，这篇观点文章聚焦于一组称为Tribbles的假激酶。Tribbles（Trbl）最初在果蝇中发现，随后在哺乳动物中鉴定出其直系同源物（TRIB1、TRIB2、TRIB3和STK40）。过去几十年的研究表明，这些蛋白质如何参与精细调控参与增殖、分化、炎症和营养变化适应等关键信号通路。因此，Tribbles蛋白（TRIBs）的失调有助于胰岛素抵抗、肥胖、II型糖尿病、动脉粥样硬化和癌症的发生和发展。在此，研究人员将讨论Tribbles假激酶发挥其功能的一些机制，以及细胞背景在定义每种TRIB（尤其是TRIB1和TRIB3）在不同病理生理情况下所扮演精确角色中的关键重要性。

**Introduction**
从蛋白磷酸化作为糖原代谢调控关键事件的初始里程碑式发现以来，细胞背景与不同信号通路间的串扰已成为塑造病理生理反应的基础。过去几十年大量研究显示，蛋白磷酸化和泛素化的失调直接参与多种疾病的发展，包括癌症、慢性炎症性疾病、糖尿病和肥胖等。由于这些翻译后修饰的重要性，编码蛋白激酶和E3泛素连接酶的基因在真核生物基因组中广泛存在。人类基因组编码超过600种E3连接酶和535种蛋白激酶。在蛋白激酶家族中，存在一组称为“蛋白假激酶”的成员。这些蛋白含有维持蛋白激酶特征性双叶结构的结构域，但缺乏催化底物磷酸化所必需的一些残基，因此假激酶不具备（或仅部分保留）催化蛋白磷酸化的能力。尽管缺乏酶活性，假激酶通过与其他蛋白的蛋白-蛋白相互作用（类似于蛋白激酶与其底物和上游调控因子的相互作用）来调控多种事件的下游信号。本评论聚焦于这一家族的一个分支：Tribbles假激酶（TRIBs），它们已成为细胞信号的重要调控因子。研究人员将讨论这些蛋白如何通过影响不同信号通路的活性来体现细胞通讯的复杂性，以及TRIBs蛋白水平或与其伴侣相互作用能力的失调如何促进疾病进展。最后，将介绍未来可能用于修饰TRIBs假激酶下游信号的途径，这些途径可被用于癌症及其他疾病的治疗。

**Tribbles pseudokinases: Discovery and structure**
Tribbles（trbl）基因最初在果蝇中发现，源于一项旨在鉴定胚胎原肠胚形成过程中控制迁移和增殖的基因筛选。突变体表现出分裂的中胚层细胞积聚，类似于《星际迷航》经典剧集“The Trouble with Tribbles”中活跃分裂的毛茸茸小动物，因此该基因及其编码蛋白被命名为Tribbles。随后在哺乳动物和（大多数）脊椎动物中发现了Trbl的直系同源物：TRIB1、TRIB2、TRIB3和STK40（SgK495）。所有Tribbles假激酶的一级序列包含三个不同区域：（i）N端区域，在亚型间存在一定变异性，含有一个PEST基序（富含脯氨酸P、谷氨酸E、丝氨酸S和苏氨酸T）；（ii）中央激酶样结构域，保留了所有活性激酶共有的DLK（天冬氨酸-赖氨酸-酪氨酸）基序，但缺乏催化活性所必需的两个其他区域：VAIK（缬氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸）基序和DFG（天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸）基序，分别参与三磷酸腺苷（ATP）配位和镁离子结合；（iii）蛋白C端，含有MEK1和COP1结合结构域，参与与E3连接酶的相互作用。此外，在TRIB1、2和3中，DFG基序已被EXLED（谷氨酸-丝氨酸/天冬酰胺/其他氨基酸-亮氨酸-谷氨酸-天冬氨酸）序列取代，而STK40直系同源物中的这个金属结合基序则完全不同。TRIB1、TRIB2和SLK40的3D结构已被解析，揭示了调控不同TRIB与其伴侣相互作用能力的可能机制。例如，TRIB1与转录因子CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）的相互作用会诱导假激酶构象变化，改变位于激活环内EXLED（TRIB1中为ESLED）基序的取向，使其从“ESLED in”转变为“ESLED out”构象。这种转换也导致蛋白C端MEK1和COP1结合基序暴露，从而促进这些基序与伴侣的结合。此外，底物肽的磷酸化阻止了这些构象变化。同样，TRIB2与稳定活性样构象的N-叶纳米抗体复合的高分辨率X射线结构，允许对肽/小分子结合该假激酶产生的开关进行广泛建模。这些观察表明，尽管TRIB没有催化活性，但它们可以呈现“活性”和“非活性”构象，这受到蛋白伴侣翻译后修饰以及可能假激酶本身的影响。同样，TRIB蛋白通过与COP1或其他E3连接酶的相互作用来调控其伴侣/底物的翻译后修饰。此外，TRIB通过蛋白-蛋白相互作用调控其底物/伴侣的活性。

**TRIBs physiological functions**
在果蝇中的研究表明，Trbl除了作为增殖和分化的负调控因子外，还通过抑制AKT来调控胰岛素反应。因此，Trbl基因抑制促进肿瘤形成，而假激酶过表达导致胰岛素抵抗，表明Trbl发挥重要的生理作用，其失调可导致病理状态。这些观察在哺乳动物中也得到部分证实，但情况更为复杂。四种哺乳动物Tribbles蛋白参与调控多种不同伴侣的稳定性或催化活性，包括在果蝇中鉴定的一些伴侣（如CdC25A、C/EBPα和AKT）。大多数研究基于哺乳动物细胞中单个基因的遗传抑制或过表达，证明TRIB蛋白在调控代谢、炎症、细胞存活和增殖等功能中发挥作用。TRIB1、2、3和STK40的表达模式尤其是功能并非总是重叠，某些情况下甚至相反。此外，TRIB1、TRIB2和TRIB3被提出可相互相互作用，这也可能决定它们与其他伴侣相互作用的能力。因此，一个尚未完全阐明的关键问题是，在哺乳动物细胞生理条件下，调控TRIB表达及其通过蛋白-蛋白相互作用修饰下游信号能力的精确机制是什么。例如，研究最广泛的家族成员TRIB3在内质网应激时上调。在内质网功能受影响的情况下（包括未折叠蛋白积累、钙耗竭或脂质代谢改变），多种信号机制通过增强真核翻译起始因子2α（eIF2α）磷酸化来抑制蛋白翻译，同时增强包括转录因子ATF4和CHOP在内的一组基因的表达，有助于恢复内质网功能。如果应激强度过高且细胞稳态无法修复，内质网应激反应也可激活程序性细胞死亡。多种刺激通过激活eIF2α上游激酶、增强eIF2α磷酸化、随后诱导ATF4和CHOP以及这些转录因子与TRIB3启动子结合来增强TRIB3表达。最近一项研究表明，RAF家族丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂也可通过刺激整合应激反应和激活真核翻译起始因子2α激酶4（EIF2AK4，也称GCN2）导致ATF4/CHOP和TRIB3上调。相反，TRIB3也参与一个抑制性反馈环，可阻止ATF4表达。在此背景下，最近一篇文章显示，动脉粥样硬化中与胆固醇积累相关的慢性内质网应激激活巨噬细胞中的ATF4-TRIB3轴，导致胞葬作用受损和动脉粥样硬化表型加重。研究人员还发现巨噬细胞胞葬作用降低、动脉粥样硬化与TRIB3 Q84R多态性之间存在相关性，该变异赋予该假激酶增强的稳定性。因此，降低巨噬细胞中TRIB3表达可能有助于减轻动脉粥样硬化斑块的发展。相反，不同的抗癌药物已被证明通过内质网应激（或整合应激反应）触发的刺激以及随后诱导ATF4-CHOP和TRIB3来抑制AKT/MTORC1轴并促进自噬介导的癌细胞死亡，或抑制癌细胞增殖。这些发现表明，在癌细胞中，TRIB3的上调/激活具有治疗价值。总之，可以得出结论，TRIB3在生理适应内质网应激中发挥关键作用，该假激酶的过度或缺陷表达可能促进/加重或减轻与这一细胞过程失调相关的病理状态。

**Context, context, context. TRIBs and the interaction with different partners in cancer**
TRIB已被证明通过蛋白-蛋白相互作用调控多种伴侣的催化活性或稳定性。某些相互作用直接抑制靶标（如TRIB3抑制AKT），而在其他情况下，TRIB被提出作为支架促进相互作用蛋白的激活（如TRIB1和TRIB2可促进AKT激活，或TRIB3可增强SMAD3、β-catenin或cMYC下游信号）。此外，TRIB可通过COP1结合结构域与E3连接酶相互作用，促进多种伴侣（包括转录因子如C/EBPα）的多聚泛素化和降解。然而，如下文所述，这些效应受到细胞背景的极大影响。TRIB在癌症领域被广泛研究，这些假激酶表现出致癌或抑癌功能。例如，TRIB1和TRIB2的增强表达通过促进C/EBPα降解来促进急性髓系白血病（AML），从而阻断分化并促进造血和髓系祖细胞的增殖。值得注意的是，TRIB1在基因组中位于cMYC附近，因此许多癌症中出现的8q24扩增导致cMYC和TRIB1等基因表达增强，支持TRIB1在白血病发生中与C-MYC及其他癌基因协同作用的观点。此外，TRIB1在实体瘤的肿瘤基质中通过调节免疫细胞群发挥不同作用。例如，一项研究表明，乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中TRIB1的高表达与治疗反应和患者生存率相关。巨噬细胞中TRIB1的基因缺失增强小鼠乳腺癌异种移植瘤的进展，这与致癌性细胞因子（如CCL20、IL6、PD-L1和VEGF）表达增加相关。有趣的是，TAMs中TRIB1表达增强也促进肿瘤生长，但通过不同机制，即降低IL15表达，有助于建立免疫抑制性肿瘤微环境。这些观察表明，在此病理背景下，TAMs中TRIB1表达的变化可能适应肿瘤生成和进展的不同阶段。另一个显示细胞背景在肿瘤发生信号中重要性的例子是TRIB3在癌症中的作用。TRIB领域的一个里程碑式发现是TRIB3抑制AKT的能力。鉴于该激酶在调控癌症起始和进展中的重要性，随后发现TRIB3基因抑制增强AKT通路已过度激活的细胞的致瘤性。因此，TRIB3缺失与RAS激活突变或PTEN表达降低（许多癌症中常见的两种初始改变）协同作用，以AKT依赖性方式促进细胞转化和增强细胞增殖。该研究显示，这种效应依赖于TRIB3调节mTORC2复合物活性的能力（该复合物负责AKT在疏水基序Ser⁴⁷³位点的磷酸化，这是激酶激活的关键事件）。据此，TRIB3基因缺失增强该位点的AKT磷酸化，并导致AKT下游靶标（BAD和FOXO1/3）的过度磷酸化。相反，TRIB3在多种癌症中上调，多项研究基于其稳定和激活不同靶标（包括AKT本身、MYC或β-catenin）的能力，提出该假激酶的致癌作用。这些观察再次指出细胞背景是决定TRIB3在癌症中作用的关键因素。在病理背景下，TRIB3水平可能在癌症生成和进展过程中发生变化。此外，驱动癌基因和抑癌基因突变的存在可能决定TRIB3在此过程中的后续作用。相应地，完全Trib3敲除动物不会自发产生肿瘤，但当它们接受致癌处理或引入抑癌基因Pten突变时，易在不同器官中发生癌前和恶性病变。这些观察支持在生理背景下，并在某些遗传场景下，TRIB3可能主要发挥抑癌作用。一个说明这种复杂情况的典型例子是TRIB3在Luminal A和Luminal B HER2⁺乳腺癌中的作用。HER2⁺乳腺癌细胞系比Luminal A对应细胞系表现出更高的TRIB3水平。然而，在Luminal B HER2⁺细胞中抑制TRIB3基因增强AKT磷酸化和细胞增殖能力，而在Luminal A细胞系中则产生相反效果。有趣的是，HER2和TRIB3似乎相互调控彼此水平。因此，一种可能的解释是，在HER2过表达背景下，TRIB3有助于减弱该受体下游的信号。据此，在Luminal乳腺癌患者队列中，TRIB3表达增强与更好的预后和较不具侵袭性的表型相关。值得注意的是，TRIB2也观察到类似现象，在不同组织和下调或过表达背景下（尤其是白血病中）表现出致癌或抑癌功能，支持其他TRIB蛋白在癌症中也可能发挥双重作用的观点。然而，尚需阐明决定TRIB在不同背景下精确作用以及这些假激酶为何优先正向或负向调控特定一组相互作用子功能的因素。

**Potential therapies based on modulating TRIBs levels and/or capacity to interact with their partners**
如上所述，TRIB蛋白失调有助于不同疾病（包括癌症）的进展或发展。同样，这些假激酶表达的改变与治疗耐药性或敏感性相关。因此，已开发出调节TRIB水平及其下游信号的策略，作为治疗某些疾病的潜在方法。由于TRIB仅在体外超生理浓度下结合核苷酸，它们可能缺乏生理上相关的酶活性。因此，这些策略遵循两种主要方法：阻断或增强TRIB与疾病发展相关伴侣的相互作用，以及最近基于TRIB与泛素-蛋白酶体系统的已知关联，使用PROTAC促进TRIB的选择性降解。以TRIB3在癌症中的调节为例简要回顾这些方法。对于那些认为TRIB3表达增强通过稳定或激活特定伴侣促进癌症进展的情况，策略基于鉴定TRIB3与其伴侣相互作用的区域，随后设计与伴侣中参与与TRIB3相互作用的序列一致的细胞穿透肽。在多种癌症类型的临床前模型中，这些肽的给药可破坏与每个特定伴侣的相互作用，逆转TRIB3的致癌作用，并增强几种化疗药物的效果。这种方法的主要优点是所设计肽的特异性，原则上仅影响TRIB3与相关靶标的相互作用。然而，此策略假设TRIB3在该肿瘤发展所有阶段均发挥核心致癌作用，且唯一受影响的TRIB3相互作用是致癌伴侣。此外，这些肽在抗癌治疗中的使用受限于其生物利用度。可能最适合使用此策略成功治疗的情况是TRIB的遗传失调直接与癌症进展相关，例如AML中C-MYC和TRIB1以及其他癌基因的同时扩增。在这种情况下，TRIB1表达增强已被证明促进疾病进展，因此可以推测设计影响该假激酶促进C/EBPα降解能力的疗法可能有助于对抗该疾病。相反，不同抗癌药物，包括天然化合物如Δ⁹-四氢大麻酚（THC）和银杏酸，以及脂肪酸衍生物ABTL0812，已被证明可增强内质网应激，导致TRIB3上调并随后抑制AKT/MTORC1轴，进而刺激自噬介导的癌细胞死亡，并显示增强TRIB3表达在多种癌症临床前模型中产生明确的抗肿瘤效应。值得注意的是，这些药物诱导TRIB3上调，但也引起癌细胞的额外变化，例如修饰鞘脂代谢或影响蛋白SUMO化，因此其作用机制不如上述细胞穿透肽直接。然而，其中一些药物已进入临床研究，并显示在患者中促进TRIB3上调。此外，这些化合物耐受性良好，未产生重要副作用，并在这些初步临床研究中显示出初步疗效信号。总之，这些观察表明，使用TRIB蛋白的药理学调节剂可能是增强这些假激酶潜在治疗活性的安全策略。

**Concluding remarks and future directions**
TRIB假激酶体现了精细调控细胞信号在生理过程调控中的重要性。由于假激酶结构域因催化活性丧失而发生的适应，TRIB已进化出与多个伴侣在不同亚细胞位置相互作用的新能力，并有助于增强或减弱关键信号通路的活性。鉴于这种主要调节性作用，在大多数场景下，TRIB水平和/或与其伴侣相互作用的失调似乎不是疾病的直接原因，但这种失调有助于增强或减弱由其他改变引起的表型。例如，完全Trib3敲除动物在短期内未显示重大异常，但具有明显易患多种疾病（包括肥胖和癌症）的倾向。未来研究应阐明调控TRIB在不同组织和发育阶段表达的机制，理解决定每个假激酶与特定一组伴侣相互作用并调控其功能的分子因素也至关重要。最终，这些方法应有助于为开发联合疗法奠定基础，包括选择性调节TRIB水平和下游信号以治疗不同疾病。