基于明胶和聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)-b-聚(L-酪氨酸)的电活性水凝胶支架，用于潜在的神经组织工程应用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Electroactive hydrogel scaffolds based on gelatin and poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine- b-poly(L-tyrosine) for potential neural tissue engineering applications

　　•一种具有导电性的杂化嵌段共聚物——聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱-b-聚(L-酪氨酸))（p(MPC)-b-p(Tyr)）已被合成。•以p(MPC)-b-p(Tyr)与明胶为原料制备出了水凝胶，进而通过冷冻干燥技术制得了3D支架。•该Ge-p(MPC)-b-p(Tyr)支架具有多孔结构、导电性以及优异的机械性能，非常适合用于软组织工程。•将IMR-32人类神经母细胞瘤细胞培养在该支架上后，证实了其具有良好的细胞相容性、黏附性及增殖能力。•该支架的导电性以及细胞与支架之间的相互作用，凸显了其在神经母细胞瘤细胞3D培养及神经组织工程中的应用潜力。

引言
神经系统损伤会引发长期的健康问题，影响运动神经元或感觉神经元的功能[1]、[2]。神经损伤可由多种原因引起，如自身免疫性疾病、创伤、感染，以及某些药物或毒素的作用[3]、[4]。脑损伤、脊髓损伤、中风以及脑膜炎或脑炎等属于中枢神经系统（CNS）的主要损伤类型[5]。而发生于CNS外的神经压迫或损伤则属于周围神经系统（PNS）损伤，相比而言，CNS损伤的再生能力更低[6]、[7]。神经退行性疾病，如硬化症和阿尔茨海默病，会因神经元逐渐丧失而破坏CNS结构[8]。无论何种疾病，神经再生始终是一项艰巨任务，因为神经系统的自我修复能力十分有限[9]。此外，神经母细胞瘤是一种源自交感神经系统未成熟神经细胞的癌症，这类细胞容易过度生长和分裂，从而形成肿瘤[10]。值得注意的是，源自人类和小鼠的神经母细胞瘤细胞是用于神经组织工程以及构建临床前模型以研究肿瘤与基质之间的相互作用以及药物反应的理想工具[10]。

尽管目前已建立了二维（2D）神经母细胞瘤细胞培养体系，但这些传统的2D系统由于缺乏代谢梯度以及细胞与基质之间的相互作用，无法呈现神经系统的复杂性与异质性[10]。相比之下，理想的3D培养环境能够维持更高的细胞密度，促进更接近生理状态的细胞分化，便于观察，并且支持直接在体内植入[12]。3D细胞培养模式可视为2D单层培养与动物体内临床前模型之间的过渡方案。相较于2D系统，3D模型能更精确地模拟微观环境；同时相比动物模型，它更具灵活性且成本更低。借助聚合物生物材料及再生医学领域的进展，有望开发出具有生理相关性的3D人类神经母细胞瘤模型[13]。最近有研究探讨了聚合物水凝胶平台在3D培养中对于神经母细胞瘤细胞形态及侵袭行为的影响[14]、[15]。尤其是那些具有仿生特性和电活性的水凝胶支架，特别适合模拟3D神经微环境及促进组织发育。重要的是，导电性有助于推动神经元分化，同时能为神经元间连接的形成提供更好的微环境[16]、[17]、[18]。

迄今为止，已有多种压电聚合物、有机导电聚合物以及压电纳米材料被用于制备导电支架[19]、[20]。例如，聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺、聚偏二氟乙烯、碳基材料（多壁及单壁碳纳米管、石墨烯、氧化石墨烯）、导电纳米材料（金和银纳米材料、压电纳米粒子）、压电陶瓷等，都被用作3D支架的构成成分以及组织再生的基质[18]、[21]、[22]。毫无疑问，由于成本较低、易于合成、稳定性好且导电性高，聚苯胺、聚吡咯和聚噻吩基支架在神经组织再生领域发挥了重要作用。然而，这些导电聚合物在加工过程中存在诸多难题，如溶解度低、细胞黏附性和生物相容性差，且在植入后会引发慢性炎症反应[23]。同样，各种纳米材料也因其形状、成分、尺寸和表面积的不同而表现出毒性，包括神经毒性、免疫毒性和基因毒性[18]。正是由于传统导电聚合物和纳米材料的这些缺陷，人们有必要开发出替代性的电活性水凝胶支架，用于神经组织工程。

理想的3D细胞培养支架应无毒、具备可调控的降解性，并且拥有能够模拟天然细胞外基质的物理和生物特性。由水凝胶制成的组织工程支架可以满足多项要求，从而为细胞与组织之间的相互作用提供适宜的3D环境[24]。目前，已有多种可生物降解的聚合物（如聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯等）被用于神经组织工程领域的研究[22]、[25]。选择合适的合成或天然聚合物对于制备水凝胶支架至关重要，只有这样才能实现结构稳定性、良好的机械性能、优异的生物相容性以及可调控的降解性，从而促进组织再生[26]。用于形成水凝胶的天然或合成聚合物及其降解产物都应具备细胞相容性。支架还应当具有理想的机械性能，以支撑长期的细胞培养，并提供多孔结构，便于细胞活动及营养物质传输。此外，其降解速率也应与细胞的生长和重组速度相匹配[27]。

为准备用于神经组织工程的支架，我们选择了明胶，并以聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)（p(MPC)）和聚(L-酪氨酸)（p(Tyr)）为原料合成了一种嵌段共聚物。鉴于其无毒性、可生物降解且不会引发免疫反应，明胶是用于神经组织工程的理想天然聚合物[25]。值得注意的是，明胶中的RGD序列可作为细胞黏附和增殖的受体[28]。与胶原蛋白及其他结构蛋白不同，明胶在加工过程中由于能与外部物质发生相互作用，因而具有较好的抗变性能力[29]。p(MPC)是一种两性离子型磷胆碱聚合物，其组成成分来源于细胞质膜中的磷脂分子[30]。由于其出色的生物相容性和保水能力，p(MPC)在组织工程领域具有很大的应用潜力。已有研究表明，p(MPC)能够促进细胞黏附[26]，而且以p(MPC)为基础的水凝胶也被用于3D细胞培养[31]。另外，p(MPC)中的磷酸胆碱类似结构片段实际上源自血小板活化因子，而血小板活化因子是一种在神经组织中起重要作用的活性脂质介质。历史上，磷酸胆碱已被证实能够调控多种细胞活动，包括参与细胞分化和神经传导过程[32]。此外，导电性也是神经组织工程支架所必需的重要特性。因此，作为传统导电聚合物的替代品，我们选择了p(Tyr)来为支架赋予电活性。p(Tyr)是一种化学性质稳定且具有生物相容性的多肽，其导电性随分子量的变化而改变。事实上，酪氨酸及其衍生的生物材料已在包括神经组织工程在内的多个生物医学领域得到应用[33]。

在本研究中，我们利用新合成的导电性p(MPC)-b-p(Tyr)嵌段共聚物与明胶共同制备出了基于聚合物水凝胶的3D支架。在合成p(MPC-b-p(Tyr)的过程中，首先通过L-酪氨酸N-羧酸酐的核酮糖开环聚合反应制备出了端炔基化的p(Tyr)（p(Tyr)-Alkyne）。与此同时，通过RAFT聚合反应得到了端叠氮基化的p(MPC)。随后，通过叠氮基-炔基点击反应合成了p(MPC)-b-p(Tyr)，并通过光谱学和电化学分析方法确认了该物质的化学结构及其导电性。之后，通过EDC-NHS介导的交联反应，以明胶和p(MPC)-b-p(Tyr)为原料制备出了水凝胶。我们研究了这种水凝胶的流变特性，进而通过冷冻干燥技术制得了3D支架。最后，利用各种光谱分析方法对支架的化学、物理及机械性能进行了表征，同时研究了其形态特征（如孔隙率与表面粗糙度）、膨胀程度、降解动力学以及热性能。在多孔的3D支架上进行IMR-32人类神经母细胞瘤细胞的长期培养后，发现这些细胞能够正常生长，且在该支架上表现出良好的细胞相容性、黏附性及增殖能力。总体而言，该支架的导电性以及良好的细胞与支架之间的相互作用，都表明它具有用于IMR-32神经母细胞瘤细胞3D培养以及未来神经组织工程应用的潜力。

材料部分
除特别说明外，所有化学品和试剂均按原包装状态使用。N, N-二甲基甲酰胺（DMF，纯度99.8%）、四氢呋喃（THF，纯度≥99.9%）、丙炔胺（纯度98%）、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（MPC，纯度97%）、3-叠氮基-1-丙醇酯-2-(十二硫醇羰基硫基)丁酸（纯度98%）、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物、四唑还原剂、碘化丙啶（PI）以及荧光素二乙酸酯（FDA）均购自Sigma-Aldrich公司。

聚(甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)-b-聚(L-酪氨酸)的合成
近几十年来，通过“可控自由基”聚合反应[52]以及点击化学[53]技术对大分子进行末端功能化修饰，为功能性嵌段聚合物及多功能生物材料的研发带来了巨大机遇。在本研究中，为了制备出兼具电活性且对细胞友好的水凝胶支架，我们结合RAFT聚合、ROP聚合以及叠氮基-炔基点击反应，合成了一种氨基封端的双嵌段共聚物（p(MPC)-b-p(Tyr)-NH2）。

结论
综上所述，我们通过结合RAFT聚合、ROP聚合以及叠氮基-炔基点击反应，成功合成了一种具有导电性的杂化嵌段共聚物——聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱-b-聚(L-酪氨酸))（p(MPC-b-p(Tyr)）。我们利用多种光谱分析技术对该共聚物的分子结构进行了详细研究。随后，以明胶和p(MPC)-b-p(Tyr)为原料，通过EDC/NHS交联反应制备出了相应的水凝胶，即Gel-p(MPC)-b-p(Tyr)水凝胶。

作者贡献说明
Supriya Jain：负责原文撰写——初稿撰写、方法设计、实验研究、数据统计分析、概念构思。
P. Abdul Junaid：负责原文撰写——审稿与编辑、方法设计、实验研究、数据统计分析。
Sandesh G. Sanjeeva：负责方法设计、实验研究、数据统计分析。
Dhanya M. Shetty：负责方法设计、实验研究、数据统计分析。
Prashanth Kumar Modi：负责资源协调、方法设计、实验研究、数据统计分析。
Shamprasad Varija Raghu：负责结果可视化、方法设计、数据统计分析。
K. Sudhakara Prasad：负责原文撰写。

资金支持
本研究得到了印度医学研究委员会（ICMR）的支持，该机构通过“研究者自主研究计划”为该项目提供了小额外部资助（编号：EM/Dev/SG/76/1284/2023）；同时也获得了印度政府下属的Anusandhan国家研究基金会（ANRF）的资助，具体形式为拉马努金奖学金（编号：RJF/2023/000077），以及印度芒格洛尔的Yenepoya大学（被认定为大学）提供的种子基金支持（编号：YU/Seed grant/144–2023）。

未引用参考文献
[56]、[59]、[67]

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
作者们对印度芒格洛尔的Yenepoya大学给予的各类支持表示衷心的感谢。

Supriya Jain | P. Abdul Junaid | Sandesh G. Sanjeeva | Dhanya M. Shetty | Prashanth Kumar Modi | Shamprasad Varija Raghu | K. Sudhakara Prasad | Saji Uthaman | Renjith P. Johnson