综述：挖掘酿酒酵母自然多样性以增强弱酸抗性

《Critical Reviews in Biotechnology》：Harnessing natural diversity of Saccharomyces cerevisiae for enhanced resistance to weak acids

　　

利用木质纤维素生物质生产第二代生物乙醇是实现能源可持续性的重要途径，但其工业化进程面临预处理过程中释放的弱酸类抑制物的严峻挑战，尤其是乙酸、甲酸和乙酰丙酸。本综述系统阐述了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）尤其是其自然分离株对这类抑制化合物的抵抗机制。相较于实验室及工业菌株，自然分离株表现出更为丰富的遗传与表型多样性，蕴含增强的抗逆性、代谢效率及对弱酸的适应性响应等独特性状。研究深入探讨了酵母应对弱酸胁迫的转录与基因组调控机制，重点解析了药物H+逆向转运蛋白、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）清除策略及细胞膜组分重塑等关键调控网络与抗性通路。同时，综述讨论了适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）、基因组改组及杂交等菌株改良策略，将其作为构建能在严苛工业发酵条件下稳定生长的高性能酵母菌株的补充手段。上述技术的整合，结合基因组与转录组学见解，为工程化高性能酵母菌株提供了系统性框架。本综述最终强调了利用自然多样性与创新生物技术策略，通过酿酒酵母发酵推动木质纤维素生物乙醇生产规模化与效率提升的巨大潜力。

引言

全球交通领域对碳基燃料的依赖严重制约了气候变化政策的有效实施，开发兼顾环境、社会与经济可持续性并能降低CO₂排放与空气污染的替代能源成为研究热点，生物乙醇在短期内被视为化石燃料的有力替代品。然而，第一代生物乙醇因依赖玉米、甘蔗等农畜原料引发伦理争议，促使研究者转向以木质纤维素生物质为核心原料的第二代生物乙醇技术。木质纤维素虽来源广泛，包括农作物秸秆、甘蔗渣、林业废弃物、城市固体废弃物及能源作物，但其结晶结构复杂，需经物理、化学或生物预处理才能释放可发酵糖，此过程会伴随产生乙酸、甲酸、乙酰丙酸、糠醛及5-羟甲基糠醛等抑制物，显著抑制核心生产菌株酿酒酵母的活性。当前研究多聚焦于实验室或工程菌株，对自然酵母分离株的挖掘不足。本综述旨在系统梳理自然酵母菌株对乙酸、甲酸和乙酰丙酸的抗性固有机制，填补甲酸与乙酰丙酸耐受机制研究不足的空白，并探讨将自然菌株多样性整合至生物燃料工业的应用前景。

木质纤维素生物质：预处理与释放的抑制物

木质纤维素由木质素（15-30%）、半纤维素（20-30%）和纤维素（20-30%）构成，不同预处理工艺会释放弱酸、呋喃类及酚类化合物抑制微生物发酵。数据显示，水解液中乙酸浓度可达0.20-10.07 g/L，乙酰丙酸为0.01-1.44 g/L，甲酸为0.01-5.50 g/L。尽管已有多种去除抑制物的策略，但多数难以实现大规模经济应用。因此，开发兼具弱酸耐受性与胞外酶高产能力的 robust 酿酒酵母菌株，是推动工业整合生物加工（Consolidated BioProcessing, CBP）降本增效的核心路径。本综述聚焦于自然分离株对水解液中乙酸、甲酸和乙酰丙酸这三类主要弱酸的抗性机制。

弱酸：特性与抗性分子机制

乙酸因在水解液中浓度较高且对酵母的影响机制研究较为深入而被广泛关注，但甲酸与乙酰丙酸即使在较低浓度下，其抑制作用也强于乙酸。弱酸可通过被动扩散、易化扩散、水甘油通道蛋白Fsp1p及特异性转运蛋白进入酵母细胞。进入细胞后，弱酸根据其pK_a值与细胞内pH解离为未解离态（RCOOH）与共轭碱（RCOO^-），引发胞内酸化与渗透胁迫，触发细胞解毒响应。弱酸胁迫会导致酵母ATP消耗增加、氧化胁迫加剧、滞后期延长，同时生长速率、存活率、胞内pH稳态及发酵能力下降，进而诱导细胞凋亡、激活解毒与应激响应通路，并破坏细胞膜组成与膜电位完整性。酵母的核心解毒策略包括上调质膜H⁺-ATP酶Pma1p以泵出胞内H⁺恢复pH稳态，以及通过Aqr1p、多药耐药（Multidrug Resistance, MDR）转运蛋白、ATP结合盒（ATP-Binding Cassette, ABC）转运蛋白与单羧酸转运蛋白Jen1p、Ady2p介导的阴离子外排。值得注意的是，乙酸耐受机制已相对明确，而甲酸与乙酰丙酸的分子耐受基础仍有待深入解析。

乙酸

乙酸源于预处理过程中半纤维素的降解，水解液中浓度通常为1-10 g/L，当浓度≥1.0 g/L时即可显著影响酵母生长。其核心毒性表现为胞内酸化、能量代谢链受损、滞后期延长及程序性细胞死亡与凋亡率上升，最终导致乙醇得率下降。此外，乙酸还会诱导细胞壁组分改变，促进脂肪酸链延长并提升膜脂肪酸不饱和指数。乙酸主要通过单羧酸转运蛋白Ady2p与通道蛋白Fps1p进入细胞，当浓度≥3 g/L时可引发显著生长抑制。

甲酸

甲酸同样来源于预处理后半纤维素的降解产物，由己糖异构化脱水生成的5-羟甲基糠醛进一步水合产生，水解液中浓度为0.1-5 g/L。尽管浓度低于乙酸，但其对酵母生长的抑制效应更强，可显著降低乙醇得率并延长发酵周期，尤其对糖酵解与蛋白质合成等关键产能通路造成干扰。分子水平上，甲酸诱导ROS水平升高，损伤蛋白质与DNA，同时下调谷胱甘肽通路基因表达，破坏线粒体功能并诱发染色质凝聚、DNA断裂等凋亡样细胞死亡特征。甲酸还可诱导细胞自噬以回收受损组分维持能量供应。胞内甲酸主要由NAD⁺依赖的甲酸脱氢酶Fdh1p催化分解为CO₂与H₂O，无能量生成。近期研究提出自然菌株耐受4 g/L甲酸的分子模型：抗性关联SAT4基因（调控潜在甲酸转运蛋白Trk1p）与FDH1的上调，以及GPD2与GPP2的上调驱动甘油代谢偏移，协同贡献渗透胁迫耐受与胞内NAD⁺再生。

乙酰丙酸

乙酰丙酸由糠醛与5-羟甲基糠醛转化生成，水解液中典型浓度为0.01-1.5 g/L。其疏水性高于乙酸，毒性略低于甲酸但显著高于乙酸。乙酰丙酸暴露会动态调控三酰甘油等中性脂质代谢，并改变细胞膜麦角固醇含量以维持膜完整性与流动性。分子层面，乙酰丙酸作为δ-氨基乙酰丙酸脱水酶的竞争性抑制剂，干扰细胞色素与血红素合成通路。研究显示，HMX1基因在乙酰丙酸耐受的氧化应激响应中起关键作用，其敲除突变体线粒体与液泡损伤分别较野生型增加2.3倍与1.5倍，但该结论仍需更多独立实验验证。

自然分离株的表型与基因组优势

相较于经历定向选育导致遗传多样性降低的工业与实验室菌株，自然分离株展现出显著的遗传与表型多样性，蕴含耐高温、耐渗透压、抗毒害及稳定乙醇合成能力等优异性状。评估其耐受性时需严格控制pH条件，因弱酸毒性随pH降低而增强，工业乙醇发酵的典型pH范围为4.0-5.0，高于此范围的耐受数据难以直接应用于工业场景。此外，混合抑制物评价体系虽更贴近水解液实际环境，但也增加了不同菌株耐受性横向比较的难度，未来筛选应紧密结合目标工艺的底物类型、预处理方式及抑制物谱系。自然分离株还具备抗杂菌污染、高效分泌胞外酶（降低CBP工艺酶制剂成本）及自发利用木糖等木质纤维素水解液中戊糖的优势。针对弱酸胁迫，其适应性响应包括：通过改变细胞壁与脂质组成降低膜通透性、质子泵驱动的胞内pH稳态维持、多药转运蛋白介导的弱酸阴离子外排，以及预激活的应激响应、代谢与氧化还原平衡通路，协同限制胞内酸积累与损伤。这些表型优势由生理与分子层面的多重适应支撑，包括高效的ROS清除、NAD⁺/NADH循环优化及膜组分重塑。

发酵环境下酵母响应弱酸的基因组与转录组核心特征

基因组与转录组研究揭示了弱酸耐受的多基因调控本质，需基于组学证据开展组合工程策略。当前相关研究多聚焦于遗传背景清晰的实验室或工业菌株，对自然分离株的探索仍显不足。实验室菌株虽便于遗传操作，但在非无菌大规模发酵环境中适应性较差；工业菌株则针对特定生产工艺优化，但其遗传多样性有限。自然分离株长期暴露于高糖、酸性环境（如葡萄园、水果表面、自发发酵体系），其进化形成的调控架构在工业相关胁迫耐受中表现出更强的稳健性。组学层面，弱酸耐受表型与倍性变异、拷贝数变异（Copy Number Variations, CNVs）、单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）、非中性变异及转录因子调控变异密切相关。

基因组特征：嵌合基因组、倍性、CNVs与SNPs

自然分离株的基因组呈现复杂嵌合结构，可赋予更优的发酵特性，如更高的乙醇得率，这与生物乙醇生产菌株的工业性能相关。水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）获得的特异基因（如赋予厌氧生长能力的URA1、工业菌株中的ASP3）可拓展代谢通路适应性。倍性多样性是环境与自然分离株的重要特征，多倍体菌株中应激响应基因的多拷贝可通过剂量效应提升适应性，研究显示三倍体菌株对乙酸、甲酸、糠醛等抑制物的耐受性显著优于单倍体。SNPs与CNVs方面，自然分离株中FDH2基因的重复与谷胱甘肽通路基因GSH2的SNPs被证实与甲酸耐受相关；PHO13敲除可提升木糖发酵菌株在乙酸与甲酸胁迫下的乙醇生产力；HMX1敲除可使乙酰丙酸耐受性提升至11.60 g/L；MIG1缺失则能解除25 g/L乙酰丙酸对生长的抑制。数量性状位点（Quantitative Trait Loci, QTL）定位进一步鉴定到多个与弱酸耐受相关的关键等位基因，如乙酸耐受相关的Snf4^E269*等位基因及其调控的TRT2、MET4、IRA2、RTG1等基因簇，以及益生菌酿酒酵母变种布拉迪酵母（S. cerevisiae var. boulardii）中扩增的细胞皮层基因PAN1，为工业菌株改造提供了候选靶点。总体而言，基因组可塑性（嵌合结构、倍性变异、SNPs与CNVs）与弱酸耐受的关联已初步建立，但实验室菌株的单基因研究结果与自然/工业分离株的复杂多基因表型间仍存在矛盾，且候选基因的功能普适性有待验证。

转录因子与转录组洞察

弱酸耐受依赖于多层级调控网络的协同作用。关键转录因子Msn2p/Msn4p、War1p、Haa1p、Rim101p、Pdr1p/Pdr3p通过调控下游应激基因表达介导抗性响应，其中HAA1与ZNF1是乙酸与乙酰丙酸响应的核心调控因子。PMA1编码的质膜H⁺-ATP酶是乙酸响应的标志性调控节点，通过质子外排拮抗胞内酸化；AQR1、TPO1、PDR12等药物H⁺逆向转运蛋白则负责将胞内弱酸阴离子外排。中心碳代谢层面，海藻糖代谢基因TPS2、TSL1、ATH1参与缓解乙酸、高温与高渗胁迫；甲酸胁迫下甘油代谢基因GPD2与GPP2的上调是重要耐受机制；乙酰丙酸胁迫则诱导三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA）与氧化磷酸化基因SDH2、COX4的表达以维持能量供应。氨基酸代谢方面，精氨酸合成通路有助于维持细胞壁与膜完整性，甲酸胁迫下甲硫氨酸合成基因MET14与高丝氨酸合成基因HOM6的上调参与资源重分配。能量平衡与解毒响应中，乙酸胁迫诱导线粒体功能与抗氧化基因SOD2、CTT1、RCK1的表达以清除ROS；甲酸解毒核心基因FDH1的诱导表达与TRK1钾转运蛋白的调控密切相关；乙酰丙酸胁迫下乙醛脱氢酶基因ALD4、ALD6的激活则参与降解产物 detox。热休克蛋白Hsp12与海藻糖等保护分子的积累也是重要的应激保护机制。当前转录组研究揭示了弱酸耐受的核心调控模块，但简化培养条件下的数据与工业/自然环境下的复杂调控网络仍存在差异，转录因子间的层级互作、代谢与膜适应的调控整合，以及转录特征对表型耐受的预测能力仍是未来研究的重点。

自然酵母菌株抗性提升与乙醇增产策略

尽管弱酸响应关键基因已逐步明晰，但将这些性状稳定导入工业适用菌株仍面临挑战。经典与现代生物技术策略的结合为自然分离株的改良提供了可行路径。适应性实验室进化（ALE）通过长期定向胁迫筛选获得有利突变，结合测序生物信息学分析可精准定位适应性变异；基因组改组则通过多轮原生质体融合与重组加速遗传重组，快速聚合不同菌株的优良等位基因。二者联用已成功获得耐受6.0 g/L乙酸的TMB3500菌株与耐受2.0 g/L甲酸+4.0 g/L乙酸的S288C突变株F3，但在自然分离株中的应用仍多局限于木糖利用或混合抑制物发酵场景。杂交技术通过工业菌株与自然分离株的杂交，可整合多抗性性状与高效代谢网络，初步研究显示自然分离株杂交后代可耐受4.8 g/L乙酸与16.3 g/L乙酰丙酸，且表现出更优的工业适应性。代谢工程则通过对特定通路与调控网络的靶向修饰提升耐受性：过表达ZNF1可使实验室菌株在3.9 g/L乙酸（pH 3.0）下的乙醇得率达理论值的86%；工业菌株Ethanol Red?过表达HAA1可在含5 g/L乙酸的糖蜜中正常发酵；delta整合TAL1与FDH1基因使工业菌株CelluX?1在65%水解液中的乙醇得率与生物量同步提升；过表达膜完整性相关基因KIC1与CDC42可缩短乙酸胁迫下的滞后期12小时并提高乙醇生产率52.99%。CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了靶点的精准修饰，如将自然分离株L20工程化用于淀粉质原料CBP；CRISPR干扰（CRISPRi）筛选鉴定到RPN9、RPT4等蛋白酶体相关基因及SEC23、SEC24等囊泡运输基因在乙酸与甲酸耐受中的关键作用。此外，引入外源调控元件（如耐辐射奇球菌的IrrE调控蛋白）也为拓展酵母抗逆边界提供了新思路。

自然酿酒酵母菌株的工业意义与未来展望

自然分离株在生物乙醇生产中潜力巨大，部分菌株可在42°C下完成葡萄糖发酵，且能高效利用甘蔗渣、淀粉废液等复杂底物。研究发现，甲酸胁迫下自然菌株YI30与CESPLG05中差异表达的HSP104、TPS1、GPD1等基因同时参与耐热、耐渗、耐低pH等多重胁迫响应，提示多靶点联合改造是应对工业复合胁迫的必要策略。这些基因特征为代谢工程提供了精准靶点，通过强化自然菌株的淀粉酶或纤维素酶分泌能力，可实现原料直接发酵，简化预处理流程。尽管重组菌株尚未实现大规模工业化应用，但Cargill公司开发的CB1菌株（从1200余株分离株中筛选获得，具备高有机酸耐受性、快速糖酵解速率与低pH发酵能力）已验证了自然多样性的工业价值。未来研究需构建三大支柱：一是建立标准化评价体系，采用统一抑制剂组合与酸性pH（≤4.0）条件，确保跨研究数据的可比性；二是发展高通量组学驱动的发现平台，整合代谢组与通量组数据，建立NADPH再生能力、ATP可用性、弱酸外排速率等耐受性代谢特征谱，实现快速规模化筛选；三是推进模块化组合工程，聚焦Haa1p调控的酸响应模块、Pma1p介导的pH稳态模块等核心网络，利用CRISPR/Cas9多靶点编辑技术将自然分离株的抗性模块移植至工业底盘菌株。通过上述路径，可将自然酵母多样性转化为具备工业适用性的弱酸耐受生物催化剂，推动第二代生物乙醇产业的规模化发展。

结论

酿酒酵母自然分离株的遗传多样性是提升生物乙醇生产水平的宝贵资源。相较于传统实验室与工业菌株，自然分离株具备耐热性、抑制物耐受性及环境波动适应性等进化优势，尤其对乙酸、甲酸和乙酰丙酸的固有耐受性使其成为克服第二代生物乙醇工艺瓶颈的理想候选。然而，性能变异性、规模化限制与发酵可控性不足仍制约其工业应用。基因型-表型关联分析、代谢工程等技术的进步为充分挖掘其潜力提供了可能，CRISPR/Cas9、QTL定位、ALE与杂交等工具的整合应用可加速定制化工业菌株的开发。本综述倡导对上述策略进行系统比较，以确定最优育种路径，并将自然菌株整合至模块化生物精炼平台，助力生物乙醇与生物基化学品的可持续生产。最终，通过产学研深度合作，将自然酵母的固有稳健性与先进工程技术相结合，有望推动生物乙醇生产体系向更具韧性与效率的方向转型，支撑全球可再生能源转型战略。