外周CD4+ T细胞上HLA-DR与CD69表达升高可预测皮肤黑色素瘤更佳临床结局

《ImmunoTargets and Therapy》：Increased Expression of HLA-DR and CD69 on Peripheral CD4+ T Cells Predicts Better Clinical Outcomes in Cutaneous Melanoma

　　

摘要背景 皮肤黑色素瘤是侵袭性皮肤癌，其发病率持续上升，已构成日益突出的公共卫生问题。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）在晚期疾病管理中取得了显著成功，但由于治疗耐药，死亡率仍然较高。因此，识别可靠的预后性和预测性生物标志物，对于优化患者分层、改进治疗选择并尽量减少不必要毒性至关重要。

摘要方法 研究人员通过将流式细胞术（flow cytometry）免疫表型分析与临床病理学数据整合，对54例初治皮肤黑色素瘤患者的循环免疫图谱进行了系统性刻画，并在其中26例患者的子集中开展了肿瘤基因表达分析。

摘要结果 循环CD4⁺ T细胞上HLA-DR和CD69表达升高，以及循环CD8⁺ T细胞频率降低，被识别为与生存改善相关的候选预后生物标志物。将这些免疫变量与临床协变量结合构建的预后模型，能够准确分层总生存（overall survival，OS）（灵敏度89.5%，特异度72.7%；AUC = 0.872，p < 0.0001）以及疾病进展/复发风险（灵敏度75%，特异度71.4%；AUC = 0.763，p = 0.001）。在随后接受ICIs治疗的43例患者子集中，循环CD4⁺ T细胞基线HLA-DR和CD69表达升高亦与治疗获益相关。整合这些标志物与临床协变量的预测模型表现出良好的区分能力（灵敏度65.2%，特异度88.9%；AUC = 0.775，p = 0.0027）。肿瘤基因表达谱分析进一步支持了IFN-γ相关特征可作为补充性的预后和预测工具，而这类特征先前已被证明与ICIs应答相关。

摘要结论 这些发现强调，全身性CD4⁺ T细胞活化状态可能是皮肤黑色素瘤中的一种潜在且易于测量的生物标志物，为未来细化患者分层并指导免疫治疗决策的策略奠定了基础。

本文发表于《ImmunoTargets and Therapy》，聚焦皮肤黑色素瘤（cutaneous melanoma，CM）外周免疫特征与临床结局之间的关系，旨在寻找可用于预后评估及免疫检查点抑制剂（immune-checkpoint inhibitors，ICIs）疗效预测的血液生物标志物。CM是死亡率最高的皮肤恶性肿瘤之一，虽然近年来抗PD-1和抗CTLA-4等免疫治疗显著改善了部分晚期患者生存，但仍有相当比例患者原发或继发耐药，且免疫相关毒性不可忽视。当前临床分层主要依赖分期、年龄、BRAF状态等临床病理指标，但同一期别患者间结局差异明显，提示现有分层体系精度有限。另一方面，既往研究常聚焦肿瘤组织来源标志物，如PD-L1、肿瘤突变负荷、肿瘤浸润淋巴细胞及IFN-γ相关基因特征，但存在组织异质性强、可及性有限、临床一致性不足等问题。因此，建立可重复、微创、动态监测的外周血标志物体系，具有明确临床需求与现实意义。

围绕上述问题，研究人员前瞻性纳入IIC–IV期CM患者，系统描绘初治患者的外周循环免疫图谱，并整合临床病理数据及随访信息，评估免疫细胞亚群频率与功能状态对总生存（OS）、无事件生存（event-free survival，EFS）以及ICI治疗获益的关联。此外，研究还在一部分患者中结合肿瘤组织免疫相关基因表达，探讨外周免疫特征与肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment，TME）之间的互补关系。研究结论表明，循环CD4⁺ T细胞活化状态，尤其是HLA-DR与CD69表达升高，与更好的生存结局及ICI治疗获益相关；同时，较低的循环CD8⁺ T细胞频率与更佳OS相关。进一步构建的联合模型在患者风险分层方面优于单纯临床变量模型，提示外周免疫表型可作为CM预后与治疗决策的重要补充依据。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究对象来源于Instituto Português de Oncologia de Lisboa Francisco Gentil前瞻性队列，共纳入85例CM患者，其中54例初治患者用于外周血预后分析，43例后续接受ICI者用于基线预测分析，26例肿瘤样本用于基因表达研究，另有15名健康供者作对照。研究人员应用流式细胞术对外周血单个核细胞（PBMCs）及部分肿瘤样本进行免疫表型分析，检测T细胞、调节性T细胞（Tregs）及单核细胞/巨噬细胞相关亚群与活化标志物；采用RT-qPCR对26基因面板进行肿瘤基因表达分析；采用ELISA测定血浆IFN-γ；并结合Cox回归、Logistic回归、ROC曲线、Kaplan–Meier分析及无监督层次聚类完成统计建模。

研究结果部分可概括如下。

Circulating Immune Profiling Reveals Functional Alterations in Advanced CM
研究人员首先比较了健康供者与初治CM患者、以及不同分期患者之间的外周免疫图谱。结果显示，主要T细胞及单核细胞亚群频率总体差异不大，III期与IV期之间也未见显著频率改变，提示CM并未显著重塑外周主要免疫细胞组成。然而在功能层面，IV期患者CD4⁺ T细胞HLA-DR表达降低，CD8⁺ T细胞CD69表达升高；其中CD4⁺ T细胞HLA-DR在IV期较健康对照亦明显降低。单核细胞方面，CM患者CD80与CD163表达下降。该部分说明，与细胞频率相比，功能性活化/极化标志物更能反映疾病进展相关的免疫变化。

CD4⁺ T Cell Activation and CD8⁺ T Cell Frequency in Blood as Potential Prognostic Indicators in CM
研究人员进一步在54例初治患者中评估外周免疫变量与临床结局的关系。单因素Cox分析显示，年龄增加及IV期与较差OS相关。免疫学指标中，循环CD8⁺ T细胞频率升高与OS变差显著相关；CD4⁺ T细胞HLA-DR和CD69表达升高则呈保护趋势，其中HLA-DR升高还与更长EFS显著相关。相关性分析提示，CD4⁺ T细胞HLA-DR与CD69并不高度相关，反映其分别代表不同活化阶段；而CD8⁺ T细胞频率与若干比值变量存在冗余，因此被保留为代表变量。进一步ROC与多变量分析表明，较高CD4⁺ T细胞HLA-DR表达可区分2年OS和EFS风险，高CD69表达与更长OS呈接近显著相关，而循环CD8⁺ T细胞频率升高则是较差OS的独立危险因素。该结果确立了三项候选血液预后标志物的核心地位。

随后，研究人员构建联合预后模型。
在OS模型中，将临床风险评分与CD4⁺ T细胞HLA-DR、CD69及CD8⁺ T细胞频率联合纳入后，模型AUC达到0.872，明显优于仅含临床变量的模型，并可有效划分高风险与低风险患者。EFS模型则纳入临床风险评分与CD4⁺ T细胞HLA-DR，AUC为0.763，同样优于单独临床评分。说明外周免疫特征可显著增强传统临床参数的风险分层能力。

Elevated HLA-DR and CD69 Expression on CD4⁺ T Cells as Potential Baseline Predictors of ICI Benefit in CM
在43例后续接受ICI治疗的患者中，研究人员评估基线外周免疫特征与治疗获益的关系。结果显示，各免疫细胞亚群频率在获益组与未获益组间差异不明显，但CD4⁺ T细胞HLA-DR和CD69表达在未获益组中倾向较低。单因素Logistic分析中两者均呈预测获益趋势。进一步分层分析发现，高CD69表达与治疗获益显著相关；多变量分析则提示CD4⁺ T细胞HLA-DR表达是独立预测因素。联合临床风险评分构建的预测模型AUC为0.775，优于仅含临床参数模型，具有中等但有意义的区分能力。研究人员还将该模型用于纵向样本，发现治疗过程中预测可靠性下降，提示这些标志物更适于基线预测而非动态疗效监测。

Tumor Immunity as a Complementary Prognostic Tool in CM
为探讨外周与肿瘤免疫之间的联系，研究人员分析了11例配对血液-肿瘤样本。结果显示，循环HLA-DR⁺ CD4⁺ T细胞与肿瘤内HLA-DR⁺及CD69⁺ T细胞频率呈正相关，提示外周活化CD4⁺ T细胞可能在一定程度上反映肿瘤内活化T细胞浸润水平；但循环细胞上标志物表达强度与肿瘤内对应表达并不完全一致。CD69表达与肿瘤CD80⁺、CD163⁺巨噬细胞浸润正相关，而循环CD8⁺ T细胞频率与任何肿瘤群体均无显著相关。

在26例肿瘤样本中，研究人员通过26基因面板进行无监督聚类，识别出两个预后不同的分群。Cluster 2患者OS和EFS均更长。差异表达分析显示，Cluster 2中共有13个基因上调，包括STAT1、CXCL9、CXCL10、IDO1、IFNG、GZMB、PRF1、FOXP3、CCR2、CCR4、TGFB、HLA-DRA和TNFA。这些基因多属于IFN-γ相关免疫激活通路，既涉及抗原呈递、细胞毒效应及趋化募集，也涵盖免疫调节反馈机制。该结果支持肿瘤内IFN-γ相关信号作为与良好结局相关的补充性生物学框架。

讨论部分指出，本研究的创新性在于将外周血流式免疫表型、临床病理信息和肿瘤基因表达整合分析，提出了CM中系统性CD4⁺ T细胞活化状态的重要临床意义。HLA-DR与CD69分别代表较晚期和早期T细胞活化状态，两者在CD4⁺ T细胞上的升高共同指向更有利的宿主抗肿瘤免疫背景。相较之下，循环CD8⁺ T细胞频率升高与较差生存相关，这一现象虽表面上与CD8⁺ T细胞抗肿瘤功能相悖，但文中仅指出其可能与外周-肿瘤间再分布有关，并未作超出证据范围的延伸推断。研究还强调，外周血标志物检测简便、微创、可标准化，具有较强临床转化潜力，可望作为现有临床分层体系和肿瘤组织标志物的有益补充。与此同时，作者也指出队列规模有限、临床异质性较高、部分临床病理信息缺失，以及多数预后队列患者后续接受ICI治疗，均可能影响纯预后效应与预测效应的区分，因此仍需在更大、多中心队列中验证。

研究结论可译为：研究人员识别出循环CD8⁺ T细胞频率以及CD4⁺ T细胞上HLA-DR和CD69表达，是CM中具有前景的预后性和预测性生物标志物。这种基于流式细胞术的简便方法，为质量流式细胞术或单细胞RNA测序等复杂且高成本的免疫谱分析技术提供了临床可行的替代方案。研究同时验证了肿瘤内IFN-γ相关信号与更优预后相关，支持其作为机制性框架及生物标志物框架的意义。总体而言，这些发现表明，全身与肿瘤免疫特征共同影响患者结局。未来仍需在更大规模、多中心队列中结合功能研究进行验证，以明确这些标志物的预后与预测价值及其潜在机制，并为优化患者分层与治疗选择开辟新路径。