《Frontiers in Immunology》：Optimization of a neuron-microglia co-culture model to explore cell-to-cell interaction dynamics
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摘要
引言：中枢神经系统（CNS）中免疫系统与神经系统之间的对话是神经科学和神经免疫学的一个基本挑战。小胶质细胞（microglia），作为大脑的驻留免疫细胞，持续与神经元通信以维持脑稳态、支持发育并协调损伤反应。
方法：研究人员采用了CEBPA/SP
摘要
引言：中枢神经系统（CNS）中免疫系统与神经系统之间的对话是神经科学和神经免疫学的一个基本挑战。小胶质细胞（microglia），作为大脑的驻留免疫细胞，持续与神经元通信以维持脑稳态、支持发育并协调损伤反应。
方法：研究人员采用了CEBPA/SPI1转录因子过表达方法，从人胚胎干细胞（hESCs）生成诱导小胶质细胞样细胞（iMG），建立了可重复且标准化的神经元-小胶质细胞共培养基线框架。iMG的表征包括关键小胶质细胞标志物（GPR34、MMP9、TMEM119、IBA1、P2Y12）的评估、以人小胶质细胞系HMC3为基准的吞噬能力，以及高分辨率扫描电子显微镜（SEM）分析。随后，将iMG与hESC来源的NGN2诱导神经元（iNeu）共培养，并对接种比例和时间参数进行了系统优化。
结果：iMG表达了关键小胶质细胞标志物，并表现出与HMC3细胞相当的吞噬能力。在共培养中，iMG表现出显著的表型可塑性，稳态和激活相关的小胶质细胞基因均上调。相应地，神经元表现出成熟和突触标志物表达的增加，表明存在双向串扰。SEM揭示了iMG形态的空间可变性——根据与神经元结构的接近程度，从分枝状转变为阿米巴状。
讨论：这种基于接触的体外系统为研究神经免疫相互作用提供了一个多功能平台，旨在进一步整合其他CNS细胞类型，并适用于研究小胶质细胞激活、神经元-小胶质细胞信号传导以及感染对CNS稳态的影响。
中枢神经系统（CNS）中神经元与胶质细胞的相互作用是维持稳态和应对损伤的核心机制。小胶质细胞（microglia）作为CNS驻留免疫细胞，在发育、突触修剪和神经炎症中发挥关键作用，但体内研究受限于CNS复杂性和人类脑组织获取困难。现有干细胞技术可生成体外模型，但多使用诱导多能干细胞（hiPSCs），存在供体变异和批次差异。为解决这一问题，研究人员采用人胚胎干细胞（hESCs）作为共同遗传背景，通过CEBPA/SPI1转录因子过表达方法生成诱导小胶质细胞样细胞（iMG），并与NGN2诱导神经元（iNeu）共培养，系统优化共培养条件，旨在建立可重复、标准化的平台以研究神经-小胶质细胞双向相互作用。该研究发表于《Frontiers in Immunology》，为理解神经免疫动态及感染对CNS稳态的影响提供了新工具。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：从hESCs（hESC-H9，WiCell）和hESCs AAVS1-TRE3G-NGN2（由JW. Harper提供）分别通过慢病毒介导的CEBPA/SPI1过表达和doxycycline诱导的NGN2过表达，在14天内分化获得iMG和iNeu。共培养时，在iMG和iNeu分别分化第10天以1:10比例接种，并采用含IL-34、M-CSF、TGFβ-1、BDNF、NT3和doxycycline的培养基维持。表征方法包括qRT-PCR检测标志物转录水平、流式细胞术分析蛋白表达、免疫荧光染色、扫描电子显微镜（SEM）观察形态、免疫金标记SEM鉴定小胶质细胞，以及pHrodo? Green E. coli BioParticles?吞噬实验评估功能。
结果部分包含以下五个子标题：
**Induced-microglia show morphological signs of microglial-like cells and the expression of stage-specific markers**
通过显微镜观察，iMG在14天分化过程中从集落状干细胞逐步转变为具分枝状突起的“静息态”小胶质细胞形态，细胞周长与核周长比显著增加（p<0.0001）。qRT-PCR和流式细胞术显示，iMG表达关键小胶质细胞标志物（GPR34、MMP9、TMEM119、IBA1、P2Y12、CD45、CCR2、CD163、CX3CR1、MHC II），其转录水平和表面蛋白表达与HMC3细胞系相当，且显著高于未分化hESCs。免疫荧光染色证实iMG高表达TGF-β1、IBA1和CD68，表明成熟和稳态表型。
**IMG show phenotypic diversity**
SEM分析揭示iMG存在多种形态表型，包括稳态（homeostatic）的星形分枝状、杆状（rod-like）、超分枝状（hyper-ramified）和阿米巴状（amoeboid），分别对应不同功能状态。阿米巴状细胞常伴细胞外囊泡，提示激活状态。
**iMG exhibit phagocytic activity**
pHrodo吞噬实验表明，iMG在1-4小时内逐步摄取绿色荧光颗粒，阳性细胞比例与HMC3细胞相当，且吞噬过程中形态从分枝状转变为阿米巴状，证实其功能性吞噬能力。
**Optimized iNeu-iMG co-culture system reveals a specific spatial organization of iMG and iNeu**
通过优化接种比例和时间，确定在第10天以1:10（iNeu:iMG）比例共培养可实现细胞存活和有效互作。SEM显示iMG在共培养中呈空间特异性分布：远离神经元时呈分枝状，靠近神经元时转变为阿米巴状，并扫描神经元间间隙。
**Neuron–microglia crosstalk modulates microglial phenotype while preserving neuronal identity**
免疫荧光染色确认共培养中神经元（TUJ1、MAP2）和小胶质细胞（IBA1、TGF-β1）标记物均表达。免疫金标记SEM进一步鉴定iMG。qRT-PCR分析显示，与iMG单培养相比，共培养中iMG的标志物（GPR34、MMP9、TMEM119、IBA1、P2Y12、CD45、CCR2、CD163、CX3CR1、MHC II）表达上调，提示神经元信号促进小胶质细胞成熟和激活。同时，共培养中神经元标志物SNAP25、MAP2、NEUN的mRNA水平高于iNeu单培养，表明小胶质细胞支持神经元成熟和突触形成。Calcein-AM染色显示共培养中细胞活力良好，且神经元轴突末端荧光信号更密集，证实无细胞毒性且维持结构完整性。
讨论部分总结：该研究通过系统优化iNeu-iMG共培养条件，建立了基于接触的体外模型，可复现体内神经-小胶质细胞相互作用的关键特征。iMG在形态、标志物表达和吞噬功能上均与HMC3细胞系相当，共培养中双向调控现象表明该模型可用于研究小胶质细胞激活、神经元信号传导及感染影响。研究结论翻译如下：总之，本研究通过整合不同的创新实验方法，在单培养或与神经元共培养条件下表征iMG的分化、成熟、激活和功能，为研究神经元-小胶质细胞相互作用、小胶质细胞功能和神经炎症过程提供了一个有价值的体外模型。
