NFATc1在存活和NFATc2在耗竭CD8+ T细胞生成中的非冗余功能

《Frontiers in Immunology》：Non-redundant functions of NFATc1 in survival and NFATc2 in generation of exhausted CD8+ T cells

　　

持续抗原刺激导致CD8⁺细胞毒性T细胞功能障碍。这些“耗竭”的TEX细胞表现出增殖能力降低、效应功能受损和共抑制受体表达增加。慢性抗原受体刺激诱导NFATc1/αA（一种短亚型）的表达，促进TEX细胞存活。NFATc1/αA的诱导伴随着NFATc2表达的显著降低。NFATc2限制了干性相关基因的表达，如Tcf7、Sell和Id3。它还支持Prf1、Gzmb和TEX标志物基因Havcr2的表达。因此，在慢性病毒感染和抗肿瘤免疫中，NFATc2的缺失减轻了CD8⁺ T细胞的功能耗竭。研究人员的发现表明，NFATc1促进TEX细胞的存活，而NFATc2促进耗竭CD8⁺ T细胞的终末分化和功能障碍。数据表明NFATc1和NFATc2之间存在非冗余的相互作用，各自在控制CD8⁺ T细胞耗竭中发挥不同作用。这些发现为增强免疫检查点和CAR T细胞疗法的疗效开辟了新途径。

**论文解读：NFATc1与NFATc2在CD8⁺ T细胞耗竭中的非冗余功能**

**研究背景与问题**

在慢性病毒感染和抗肿瘤免疫中，CD8⁺ T细胞的功能耗竭是核心特征，表现为增殖能力下降、效应功能受损及共抑制受体（如PD-1、TIM-3）表达升高。活化的T细胞核因子（NFAT）转录因子家族是Ca²⁺/钙调磷酸酶（CN）信号通路下游的关键调控因子，控制T细胞激活、克隆扩增和耗竭。在外周淋巴细胞中，主要表达NFATc1和NFATc2两个成员。尽管两者结合相似的DNA基序并类似地反式激活基因，但基因敲除小鼠呈现不同表型：NFATc1缺失导致胚胎致死，而NFATc2缺失导致淋巴细胞过度增殖和免疫反应增强。此外，NFATc1基因在抗原受体刺激后通过正反馈自调控机制强烈诱导，产生短亚型NFATc1/αA；而NFATc2呈组成型表达。此前研究认为NFAT家族成员（包括NFATc1）在缺乏Jun/Fos AP-1因子相互作用时促进耗竭，但这一观点与NFATc1和NFATc2在基因调控、增殖和凋亡中特异性功能的发现相矛盾。因此，研究人员旨在详细探究NFATc1与NFATc2在鼠CD8⁺ T细胞耗竭过程中的不同作用。

**研究内容与结论**

研究人员利用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）慢性感染模型和B16黑色素瘤模型，结合NFATc1、NFATc2单基因及双基因敲除小鼠，通过过继转移、体外慢性刺激、RNA测序（RNA-seq）及流式细胞术等技术，揭示了NFATc1和NFATc2在CD8⁺ T细胞耗竭中的非冗余功能。结论表明：NFATc1/αA主要支持耗竭T（TEX）细胞的存活，而NFATc2则驱动TEX细胞的终末分化与功能障碍；NFATc2缺失可减轻耗竭、增强抗肿瘤免疫。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术：1）小鼠模型：使用LCMV Armstrong（急性）和Docile/Clone 13（慢性）株感染P14 TCR转基因小鼠，以及B16.OVA黑色素瘤模型在Rag1^-/-免疫缺陷小鼠中建立肿瘤；2）过继转移实验：将等量野生型（WT）、NFATc1缺陷和NFATc2缺陷的P14 CD8⁺ T细胞（携带不同荧光报告基因）共转移至受体小鼠，监测感染后T细胞扩增与分化；3）体外慢性刺激方案：用抗CD3/CD28抗体加IL-2初始刺激2天，随后每2天用抗CD3再刺激，模拟持续抗原接触；4）RNA bulk测序：对体外慢性刺激的WT、ΔE2、NFATc1^-/-、NFATc2^-/-及双敲除（DKO）CD8⁺ T细胞进行转录组分析；5）流式细胞术与免疫印迹：检测细胞表面标志物、凋亡蛋白（Bim、Bcl-2）及NFAT蛋白表达；6）细胞毒性实验：将OT-I TCR转基因T细胞与B16.OVA黑色素瘤细胞共培养，测定杀伤活性。样本小鼠来源为德国维尔茨堡大学实验医学中心。

**研究结果**

**1. NFATc1/αA RNA在耗竭CD8⁺ T细胞中的诱导**

通过qPCR检测经LCMV慢性感染小鼠的FACS分选细胞，发现TPEX（CD44⁺PD-1⁺Ly108⁺TIM-3^-）和TEX（CD44⁺PD-1⁺Ly108^-TIM-3⁺）细胞中编码短亚型NFATc1/αA的Nfatc1a RNA水平较静息T细胞升高10-20倍，而Nfatc2和Nfatc3 RNA无显著变化。单细胞RNA测序数据进一步证实TEX细胞中Nfatc1占主导表达，NFATc1蛋白水平在TPEX和TEX中均升高。

**2. NFATc1和NFATc2控制病毒特异性T细胞的存活与衰竭**

在急性LCMV感染中，NFATc1缺陷P14细胞仅轻度减少；但在慢性LCMV感染后15天，NFATc1缺陷细胞几乎无法检测，表明NFATc1对持续抗原刺激下的T细胞存活至关重要。NFATc2缺陷则导致KLRG1^-IL-7Rα⁺记忆前体细胞增加，并在慢性感染中提高Ly108⁺TIM-3^- TPEX细胞频率，减少Ly108^-TIM-3⁺终末TEX细胞，证明NFATc2促进终末耗竭。

**3. NFATs体外控制CD8⁺ T细胞耗竭**

通过体外慢性刺激方案，慢性刺激的CD8⁺ T细胞高表达PD-1、LAG-3和TIM-3，且Ifng诱导能力降低。NFATc1和NFATc2双缺陷T细胞中，耗竭标志基因Pdcd1、Lag3和Tigit RNA水平显著下降，而CD44、CD69和增殖标志Top2a表达正常，表明NFATs对耗竭程序的建立至关重要。

**4. NFATc1缺陷CD8⁺ T细胞在慢性抗原刺激下存活受损**

共培养实验中，NFATc1缺陷细胞在慢性刺激6天后数量降至NFATc2缺陷细胞的一半，而急性刺激下无差异。NFATc1缺陷细胞中凋亡细胞比例、caspase 3/7⁺细胞频率及Bim/Bcl-2蛋白比值均升高，提示NFATc1通过抑制Bim促进存活。

**5. NFATc2支持TEX标志基因**

RNA-seq主成分分析显示，NFATc2缺陷或DKO细胞转录组与WT和NFATc1缺陷细胞显著不同。NFATc2缺失导致TPEX相关基因（如Tcf7、Slamf6、Id3、Sell）上调，而终末TEX标志基因（如Pdcd1、Tigit、Havcr2、Gzmb、Prf1）下调。NFATc1缺陷仅引起轻度变化，且NFATc1缺陷细胞中Nfatc2 RNA代偿性升高。

**6. NFATc2驱动CD8⁺ T细胞耗竭**

在体外细胞毒性实验中，慢性刺激的NFATc2缺陷OT-I T细胞杀伤B16.OVA黑色素瘤细胞的能力与急性刺激T细胞相当，而WT和NFATc1缺陷TEX细胞杀伤能力极低。NFATc2缺陷细胞表面PD-1、TIM-3、LAG-3和TIGIT表达频率降低，穿孔素（Prf-1）表达升高，且TOX蛋白水平降低，TCF-1表达升高，表明NFATc2驱动终末分化。

**7. NFATc1/αA诱导干扰耗竭CD8⁺ T细胞中NFATc2表达**

免疫印迹显示，慢性刺激下核NFATc1/αA蛋白强烈诱导，而NFATc2蛋白水平降低；在ΔE2（E2增强子缺失）或NFATc1缺陷细胞中，NFATc2未被抑制。此外，NFATc2缺陷细胞中NFATc1表达增强，表明NFATc1/αA通过抑制NFATc2积累维持TPEX状态。

**8. NFATc2缺失改善CD8⁺ T细胞的抗肿瘤活性**

在B16黑色素瘤模型中，过继输注NFATc2缺陷OT-I T细胞的小鼠肿瘤生长显著延缓，而NFATc1缺陷或ΔE2细胞无此效果。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）分析显示，NFATc2缺陷TIL中Ly108⁺TIM-3^- TPEX细胞比例增加，Ly108^-CD69⁺终末TEX细胞减少，且PD-1、TIM-3和CD69表达降低，中央记忆型（CD44⁺CD62L⁺）T细胞比例升高。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，NFATc1/αA并非直接驱动耗竭，而是通过上调Bcl-2、抑制Bim来维持TPEX和TEX细胞的存活；同时，NFATc1/αA通过抑制NFATc2表达防止终末分化。NFATc2则通过促进TEX标志基因（如TOX、NR4A家族）表达和抑制干性基因（如Tcf7）来驱动终末耗竭。NFATc2缺失可使T细胞保持TPEX特性，增强抗肿瘤活性。

研究结论：NFATc1（特别是诱导型NFATc1/αA）支持CD8⁺ T细胞在慢性抗原刺激下的存活，而NFATc2促进其终末分化和功能障碍。NFATc2缺失保留了前体样特征并增强过继转移CD8⁺ T细胞的抗肿瘤功效。这些发现将NFATc2定位为增强CAR T细胞功能的潜在治疗靶点。