佐剂重组血凝素疫苗早期免疫应答的空间转录组图谱

《Frontiers in Immunology》：Spatial transcriptomic mapping of early immune responses to an adjuvanted recombinant hemagglutinin vaccine

　　

疫苗接种依赖于在注射部位启动的先天性和适应性免疫应答，随后在引流淋巴结中激活。然而，目前仍缺乏高多重性、空间分辨的图谱，能够随时间推移将注射部位信号与引流淋巴结中的转录组程序联系起来。在此，研究人员利用空间转录组学技术，对与赛诺菲（Sanofi）专有水包油佐剂AF03配制的佐剂重组血凝素（rHA）蛋白疫苗的早期应答进行了图谱绘制。小鼠接受了肌肉注射的rHA蛋白或磷酸盐缓冲液（PBS）。在初次免疫后第1天和第7天，收集注射部位肌肉和引流淋巴结，用于GeoMx?数字空间图谱（DSP）和CosMx?空间分子成像（SMI）单细胞成像。在淋巴结中，rHA蛋白疫苗接种在第1天诱导了非滤泡区域的早期先天性通路激活。到第7天，适应性通路在滤泡内富集，差异表达基因（DEGs）与生发中心（GC）形成、转录调控和信号传导相关。这些变化与滤泡区域内增殖性GC样B细胞簇的扩增同时发生。在注射部位，使用了20×20微米的空间网格而非分割细胞。富含成纤维细胞和肌肉细胞的聚类在第1天显示趋化因子和干扰素刺激基因的诱导，集中在成纤维细胞丰富的基质层。这些空间组织的组织程序伴随着短暂的系统性细胞因子升高和抗原特异性IgG滴度的增加。总之，这些数据提供了先前未解决的视角，揭示了在接种佐剂rHA蛋白疫苗后的早期应答中，局部炎症和淋巴结组织在空间和时间上如何关联。

**论文解读：佐剂重组血凝素疫苗早期免疫应答的空间转录组图谱**

**研究背景与目的**
疫苗接种是有效的公共卫生干预手段，依赖于注射部位引发的先天性和适应性免疫应答，并随后在引流淋巴结中激活。尽管已知佐剂蛋白疫苗可诱导注射部位与淋巴结间的协调免疫反应，但现有研究多采用分离的细胞、组织学或转录组学方法，缺乏高多重性、空间分辨的整合图谱，难以揭示免疫信号在完整组织中的时空动态。本研究旨在利用空间转录组学技术，系统解析AF03佐剂重组血凝素（rHA）蛋白疫苗在注射部位肌肉和引流淋巴结中的早期免疫应答时空特征，明确免疫应答在何处、何时以及如何发生，为优化疫苗设计提供基础。论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用GeoMx?数字空间图谱（DSP）和CosMx?空间分子成像（SMI）单细胞成像技术，对小鼠（BALB/c，雌性，每组3只）注射部位肌肉和引流淋巴结进行空间转录组分析。样本来源于初次免疫后第1天和第7天收集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。GeoMx? DSP使用小鼠全转录组图谱探针，通过形态学标记（B220、CD138、Ki-67）选择感兴趣区域（ROI），分为滤泡和非滤泡区域。CosMx? SMI使用小鼠通用细胞表征1K RNA面板，对淋巴结进行单细胞分割，对肌肉组织使用20×20微米空间网格。数据通过R语言工具包进行质量控制、归一化、差异表达分析（limma）和通路富集（REACTOME）。同时，使用Luminex多重细胞因子检测和ELISA测定系统性细胞因子和抗原特异性IgG滴度。

**研究结果**
**3.1 空间转录组学揭示引流淋巴结中时间和区域不同的免疫激活**
通过GeoMx? DSP分析，主成分分析（PCA）显示淋巴结转录组变异主要来源于解剖区域（滤泡与非滤泡）。在滤泡区域，第7天佐剂rHA蛋白处理组与PBS对照相比沿PC2轴分离更明显。差异表达分析（DEGs）发现，第7天滤泡区域中DEGs数量增加超过10倍，富集于生发中心（GC）形成、转录调控和免疫信号相关基因。基因集富集分析（GSEA）显示，第1天在非滤泡区域中，佐剂rHA蛋白组先天性和适应性通路（如C型凝集素受体、Fc受体、中性粒细胞脱颗粒、BCR/TCR信号）显著富集；到第7天，适应性通路（如IL-12/JAK-STAT信号）在滤泡和非滤泡区域均富集，且先天性模式识别受体（PRR）通路活性从第1天的非滤泡区转移到第7天的滤泡区。系统性细胞因子（G-CSF、IL-6、IL-13等）在接种后6小时显著升高，随后下降，并与HA特异性IgG滴度升高相关。

**3.2 单细胞空间转录组学确认佐剂rHA蛋白淋巴结中GC组织与细胞动力学**
CosMx? SMI分析约37.9万个淋巴结细胞，鉴定出16个聚类，包括B细胞、T细胞、树突状细胞（DCs）、内皮细胞、中性粒细胞等。c11 B细胞簇在佐剂rHA蛋白第7天组中显著富集，表达细胞周期相关基因（Hmgb2、Mki67、Stmn1、Ube2c）和早期B细胞标记Cd24a，下调静息/记忆B细胞基因（Sell、Cd55、Bcl2），表型为增殖性GC样B细胞。c8浆细胞簇也在第7天富集。细胞周期免疫通路的GSVA评分空间映射显示，在佐剂rHA蛋白第7天组中，该通路活性主要集中在滤泡区域，而PBS对照组仅在滤泡外少量区域有活性。

**3.3 注射部位空间转录组学突出佐剂rHA蛋白疫苗肌肉中早期成纤维细胞和肌肉细胞激活**
注射部位肌肉组织使用20×20微米空间网格分析，鉴定出6个空间网格聚类，包括肌肉富集（c1、c2、c6）、成纤维细胞富集（c3）、脂肪细胞富集（c5）和免疫相关（c4）聚类。第1天，成纤维细胞和肌肉富集聚类中DEGs数量最多，主要是免疫相关基因（如Cxcl5、Cxcl12、Ifitm2、Ifitm3、Mt1）。GSEA显示，与PBS相比，佐剂rHA蛋白第1天在成纤维细胞富集聚类中上调了中性粒细胞脱颗粒、先天免疫系统和细胞因子信号通路。空间映射显示这些基因在成纤维细胞富集区域高表达，第7天表达下降，而PBS对照组仅有微弱干扰素刺激基因（ISG）上调。

**讨论与结论**
讨论部分指出，AF03佐剂rHA蛋白疫苗诱导了时空分明的免疫图谱：注射部位成纤维细胞和肌肉细胞中趋化因子/细胞因子及干扰素刺激基因（ISG）的早期激活，与淋巴结中第1天非滤泡区域先天性通路激活和第7天滤泡区域GC样活性相关。这种微解剖免疫转录组景观此前未在油包水乳液佐剂重组蛋白疫苗中描述。研究局限性包括：仅选择第1天和第7天两个时间点，未包含加强免疫或更晚时间点；未设置AF03佐剂单独对照组；样本量较小（每组3只小鼠）；CosMx? SMI使用靶向1000-plex面板，未涵盖所有GC标记（如Bcl6、Aicda、S1pr2、Gcsam），限制了GC B细胞身份的精确鉴定。

**结论部分翻译**：总体而言，通过以细胞和空间分辨率定义局部和下游免疫应答，本研究提供了先前未解决的视角，揭示了在接种AF03佐剂rHA蛋白疫苗后第一周内，注射部位和引流淋巴结中免疫应答发生的时间、地点和方式。将这些结构变化与佐剂驱动的先天信号和下游测量联系起来，为理解疫苗效力增加了额外的分辨率。未来研究可采用敲除小鼠模型或体外扰动实验，以建立注射部位与引流淋巴结之间免疫事件的机制联系，涵盖免疫衰老、替代疫苗递送途径和重复接种等场景。