通过纤维素提取和斜生四链藻培养实现葡萄渣的可持续增值：一种生物精炼方法

《Frontiers in Chemical Engineering》：Sustainable valorization of grape pomace via cellulose extraction and cultivation of Tetradesmus obliquus: a biorefinery approach

　　

摘要：引言：葡萄渣是一种有前景的农业工业残留物，由于其高含量的生物活性化合物和营养素，在可持续生物精炼应用方面具有巨大潜力。本研究评估了其作为斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）在光生物反应器中培养的底物，及其对生物质生长和生化组成的影响。方法：使用博尔德基础培养基（BBM）运行三个光生物反应器：一个补充了通过酸水解获得的葡萄渣提取物（E1），另一个补充了通过微波辅助乙醇提取获得的葡萄渣提取物（E2），以及一个仅含BBM的对照组。通过测量细胞密度、生长动力学和pH值，监测微藻培养30天。培养后，分析了脂质谱、蛋白质含量、矿物质积累、抗氧化活性和纤维素结晶度。结果：所有处理均表现出典型的生长动力学，在第5至10天之间呈指数生长期，第26天达到最大细胞密度。E2促进了最高的生物质生长，达到1.34×10⁷ cells mL^-1，比生长速率为0.083 day^-1。相比之下，E1通过增加蛋白质含量、抗氧化活性和纤维素结晶度，同时降低饱和脂肪酸比例，提高了生物质质量。讨论：葡萄渣提取物有效调节了斜生四链藻的生长和代谢。E2有利于生物质生产力，而E1增强了生物质的生化特性，证明了葡萄渣作为微藻培养可持续底物的潜力，并支持其在综合生物精炼过程中的应用。

全球葡萄酒产业每年产生约849万吨葡萄渣（占加工葡萄质量的20%–25%），其高有机负荷和季节性积累构成环境挑战。葡萄渣富含酚类化合物（如没食子酸、咖啡酸）、膳食纤维和木质纤维素，具有抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病和抗炎活性，但将其作为微藻培养底物的整合研究尚不充分。斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）具有高生长速率、蛋白质积累（干重30%–40%）和代谢可塑性，适合生物精炼。本研究旨在通过葡萄渣提取物调控斜生四链藻的生长和代谢，探索可持续增值途径，并评估纤维素回收质量。论文发表在《Frontiers in Chemical Engineering》。

研究人员开展了以下研究：使用三个30 L光生物反应器，分别添加酸水解葡萄渣提取物（E1）、微波辅助乙醇提取物（E2）和仅含BBM的对照组，培养斜生四链藻（菌株CICLO_00125，来自巴西Ciclo Biotecnologia Ambiental公司）30天，监测细胞密度、生长动力学和pH，并分析生化组成、抗氧化活性和纤维素结晶度。葡萄渣来自葡萄牙Carmim合作社酒庄的'Touriga Nacional'品种。

主要关键技术方法包括：①葡萄渣样品的制备（干燥研磨成粉，来源注明）；②提取物制备（酸水解E1：0.8% H₂SO₄，90°C，1 h；微波辅助乙醇提取E2：408 W，24%乙醇，5 min）；③微藻培养（30 L光生物反应器，BBM培养基，22±2°C，16/8 h光暗周期，100 μmol photons m^-2 s^-1，通气）；④生物质表征（蛋白质：凯氏定氮法；碳水化合物：苯酚-硫酸法；色素：分光光度法；脂质：Bligh-Dyer提取及GC-MS分析脂肪酸甲酯；矿物质：FAAS/F AES；抗氧化活性：DPPH、ABTS、FRAP法；总酚：Folin-Ciocalteu法）；⑤纤维素提取（超声、甲苯/乙醇脱脂、24% NaOH碱处理、NaClO漂白）及FTIR和XRD表征。

结果部分：

3.1 斜生四链藻培养和生物质生产参数：所有处理均表现出典型生长动力学，指数生长期在第5–10天，第26天达到最大细胞密度。E2组细胞密度最高（1.34×10⁷ cells mL^-1，比生长速率0.083 day^-1），对照组次之，E1组最低。pH值从6.8逐渐升至8.5以上，电导率变化不大。表明E2提取物对生长有正向调节，而E1因酸水解可能产生抑制物且浓度低未支持混合营养。

3.2 理化表征：E1的叶绿素a和b含量与对照组相似，E2显著降低（p<0.05），β-胡萝卜素无显著差异。碳水化合物含量（约10%–11%）各处理间无显著差异。E1蛋白质含量最高（23.71%±0.57%），显著高于对照组和E2。灰分含量E1和E2低于对照组。脂肪酸分析：对照组总脂肪酸含量最高（22.42 mg/g），以多不饱和脂肪酸（PUFA）为主，C18:3和C18:2最丰富，并检测到C16:4。E1总脂肪酸降低（18.18 mg/g），PUFA比例下降，C16:4增加；E2脂肪酸谱与对照组相似（18.49 mg/g）。矿物质：E1积累Cu、Zn、Na较高；E2钾（K）和锰（Mn）较高；对照组铁（Fe）最高。表明E1酸水解释放更多矿物质，促进蛋白质合成和特定元素积累。

3.3 抗氧化活性和总酚：总酚含量无显著差异。DPPH法中E1和E2活性显著高于对照；ABTS法对照活性最高；FRAP法E2活性最高。说明抗氧化活性取决于分析方法，不同提取物诱导了不同的抗氧化代谢响应。

3.4 纤维素提取：FTIR显示提取的纤维素具有典型特征峰（3330–3400 cm^-1 O-H伸缩，2900 cm^-1 C-H伸缩，1428 cm^-1 CH₂弯曲，1030 cm^-1 C-O伸缩，897 cm^-1糖苷键）。XRD分析显示E1纤维素结晶度最高（36.73%），E2次之（25.64%），对照组最低（24.44%）。表明E1提取物诱导了更强的细胞壁加固响应，促进纤维素有序排列。

讨论部分总结：E2促进生长可能因其微波辅助乙醇提取保留了高生物活性酚类化合物，作为代谢调节剂降低氧化应激；E1生长较低因酸水解产生糠醛等抑制物且浓度低（0.2 g L^-1）不足以支持混合营养。pH升高至8.5以上限制了CO₂可用性，导致第26天后细胞密度稳定。E1高蛋白质和矿物质含量归因于酸水解释放了更多有机氮和矿物质，而E2低灰分因乙醇提取选择性回收有机化合物。纤维素结晶度差异表明E1酸水解产物作为化学刺激促进了纤维素合成基因表达和细胞壁加固，而E2作用较弱。总体而言，提取方法显著影响微藻生长、代谢及纤维素结构质量。

研究结论：本研究表明，葡萄渣是斜生四链藻培养的有效底物，影响生长动力学和代谢组成。所有处理均表现出典型生长动力学，第5–10天指数生长期，第26天后稳定，可能与pH升高至8.5以上导致的CO₂限制有关。微波辅助提取物（E2）促进了更高的细胞密度，而酸水解（E1）诱导了更强的代谢转变和更低的饱和脂肪酸。E1还提高了蛋白质和矿物质含量，抗氧化反应因提取方法而异。此外，从生物质中提取的纤维素在结构组织和结晶度上存在差异，E1结晶度最高，对照组最低。总体而言，结果表明葡萄渣衍生的提取物不仅影响微藻生长和生化组成，还影响所得纤维素的结构质量，加强了葡萄渣在可持续微藻生物精炼中的潜力。