无创经脊髓直流电刺激改善肥胖相关性中枢性低通气综合征小鼠模型的呼吸

《Neuroscience Bulletin》：Noninvasive Trans-Spinal Direct Current Stimulation Improves Breathing in Mice Modeling an Obesity-Associated Central Hypoventilation Syndrome

　　

尊敬的编辑：

肥胖低通气综合征（Obesity Hypoventilation Syndrome, OHS）是一种与肥胖相关的神经呼吸疾病，估计影响全球0.4%的成年人口，目前尚无有效的根治性治疗。OHS可导致显著的心肺并发症，从而降低生活质量并增加死亡风险。其患病率在体重指数（body mass index, BMI）为30–35 kg/m²的患者中可达11%，BMI为35–40时可达20%，BMI＞40时可达30%，而BMI＞50 kg/m²时最高可达48%。OHS通常被定义为以下情况的组合：肥胖（BMI＞30 kg/m²）、日间高碳酸血症（清醒状态动脉pCO₂＞45 Torr），以及睡眠呼吸障碍，且不存在其他可解释低通气的原因（如限制性肺部或胸壁疾病、抑制性药物使用或其他中枢性低通气综合征）。除肥胖所致机械负荷外，中枢呼吸驱动的改变被认为在OHS发生中具有决定性作用，这似乎是一种涉及中枢leptin抵抗的获得性现象。

既往研究已报道，在健康人体中，上颈段阴极经脊髓直流电刺激（trans-spinal direct current stimulation, tsDCS）单次施加可增加皮质-膈肌兴奋性及潮气量（tidal volume, V_T），重复施加则伴随呼吸频率（respiratory frequency, f_R）升高。这些效应既发生于刺激期间，也持续至刺激终止之后。其潜在机制可能涉及膜电位的瞬时改变、通过类似长时程增强/长时程抑制过程（long-term potentiation/depression-like processes）介导的突触改变，或涉及神经发生（neurogenesis）的非突触效应；上述机制均被认为是直流电刺激（direct current stimulation, DCS）诱导神经可塑性（neuroplasticity）的基础机制。无论具体机制为何，施加于上颈段的阴极tsDCS均可能为治疗性研究提供路径，将tsDCS作为增强中枢性低通气患者呼吸的工具，例如用于OHS患者。

鉴于阴极颈段tsDCS可通过中枢作用增强健康人体通气，并假定该效应以神经可塑性为基础，研究人员提出：将阴极tsDCS施加于leptin缺陷型肥胖小鼠（Lep^ob/ob）的上颈段区域——该模型可模拟人类OHS的特征，包括PaCO₂升高及对CO₂的通气反应减弱——可能通过调节控制呼吸的神经网络中神经元的活动而改善通气。为验证这一假设，研究人员首先将用于人类的无创经皮颈段tsDCS方法移植至成年小鼠，并进一步联合全身胸膜描记记录（whole-body plethysmographic recording）、SpO₂测量、功能与表型组织学（functional and phenotypic histology）以及RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析。由于实验方案包含连续5 d的颈段tsDCS，仅纳入雄性小鼠，以避免雌性在5个连续日程中因卵巢周期持续而不可避免出现的性激素波动，防止无法形成在整个tsDCS方案期间同步于同一周期阶段的均一化雌性群体。

总体而言，tsDCS通过增加f_R和V_T，显著增强了Lep^ob/ob小鼠的分钟通气量（minute ventilation, V?_E）。与tsDCS前相比，f_R自第1天刺激（D1）起增加16%，并持续至D5。tsDCS组与假刺激（sham）组比较显示，除D4外，tsDCS组小鼠每日f_R均显著高于sham组。V_T在tsDCS组中自D1至D4较刺激前升高。与上述结果一致，V?_E在整个tsDCS过程中均较刺激前增加。但需指出的是，反复麻醉可能因对通气的潜在抑制作用而削弱tsDCS的刺激效应。此外，阴极颈段tsDCS还通过减少低通气状态（SpO₂≤95%）所占时间，改善了Lep^ob/ob小鼠的去氧合情况。尽管在记录期内SpO₂并未显著升高，tsDCS组小鼠低通气持续时间少于sham组；与刺激前相比，自D2至D5其SpO₂≤95%的时间显著减少。组间比较显示，D1时tsDCS组SpO₂≤95%的时间较sham组增加，而D4时则相反，sham组该时间较tsDCS组增加。值得注意的是，阴极颈段tsDCS同样可增加健康小鼠的V?_E。该通气效应似具有特异性，因为其他生理变量未见变化。

为评估颈段阴极tsDCS对Lep^ob/ob小鼠脑干呼吸神经网络的影响，研究人员比较了tsDCS组与sham组在延髓和脑桥中的cFos表达；这些脑干区域包含控制向胸腹部呼吸肌输出中枢呼吸驱动的呼吸网络。在延髓中，研究人员观察到腹侧结构中cFos表达显著增加，包括疑核（ambiguus nucleus, Amb）、延髓腹外侧网状核（ventrolateral medullary reticular nucleus, VLM）、苍白中缝核（Raphe Pallidus, RPa）、隐中缝核（Raphe Obscurus, ROb）以及后梯形核（retrotrapezoid nucleus, RTN）。在脑桥中，所分析的呼吸相关结构内cFOS阳性细胞数量无显著变化。

为探讨颈段阴极tsDCS刺激自主呼吸并改变Lep^ob/ob小鼠cFos表达的潜在机制，研究人员在tsDCS施加部位——颈髓——以及延髓和脑桥中开展了RNA-seq分析。由于分析样本量较小，该研究具有探索性，但其结果提示与现有tsDCS/DCS文献一致的发现。仅有少数基因的表达受tsDCS调控，其中相当部分与可塑性现象相关：Egr2、Egr4和Fosb编码与神经可塑性相关的转录因子；Car8、Gabra6、Gabrad和Clic6与神经传递直接相关；Cbln3和Gh参与维持神经元完整性或突触结构；En2参与神经环路稳定或发育。对这些编码与神经可塑性相关转录因子的基因调控，RT-qPCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction）结果予以证实：在颈髓中，Egr2、Egr4和Fosb表达上调；在延髓中，Egr4和Fosb表达上调。

最后，为评估tsDCS的呼吸效应是否涉及神经炎症过程调控，研究人员对那些出现tsDCS诱导cFOS阳性神经元密度变化的结构中的小胶质细胞（microglia）进行了形态学分析。结果显示，在所有表现出cFOS分布变化的呼吸控制相关结构中，小胶质细胞密度、分支数量及分支长度均未发生变化。RNA-seq数据亦显示，仅有极少数涉及炎症过程的基因受到调控：在三个分析区域中为Icam1和Lcn2，延髓中为Il16、Il20rb、Crtam，脑桥中为Nlrp10。

综上，本研究确立了经皮阴极tsDCS作用于上颈段区域在中枢性低通气综合征前临床模型——Lep^ob/ob小鼠——中的呼吸刺激效应。该刺激效应降低了低通气程度，并在伴随神经可塑性现象的同时，增强了脑干呼吸网络中的神经元活动。需要指出的是，这一效应在健康野生型（wild type, WT）小鼠中同样存在，这与既往在健康受试者中获得的数据一致，支持其作为一种不依赖是否存在中枢性低通气的呼吸兴奋效应。尽管大量研究和临床试验已为经颅DCS在卒中、运动障碍或学习等神经系统疾病中的应用提供了坚实证据，本研究数据首次提示，施加于上颈段水平的tsDCS可纠正呼吸控制的中枢缺陷。颈段阴极tsDCS诱导的呼吸增强依赖于f_R和V_T的双重升高——其中对f_R的作用更强——且该效应足以减少低通气持续时间。但应注意，小鼠平均SpO₂未发生变化，这可能与记录期间动物处于清醒状态、从而减少低通气有关。研究人员自首次刺激即观察到f_R升高，而健康人中该现象仅在重复刺激后出现。这种f_R效应提示，颈段阴极tsDCS可调节脑桥-延髓呼吸网络，尤其是延髓内的呼吸节律发生器。既往对人类C3–C5水平tsDCS所致电场的建模显示，电场可沿纵向侵入脑干，这可能与脊柱的“电缆样结构”有关：导电核心（脊髓与脑脊液）外包裹绝缘鞘（椎柱）。Fernandes及其合作者的研究显示，延髓腹侧与背侧以及脑桥背侧均可能受到C3–C5水平tsDCS产生电场的影响，这与脑桥-延髓呼吸网络受调节完全一致。另一种可能是，脑桥-延髓呼吸结构的刺激依赖于上行感觉通路的调节。支持该可能性的证据在于，既往报道显示阴极tsDCS有增加外周神经刺激诱发体感电位振幅的趋势。在这两种情形中，无论在小鼠还是人类，颈段tsDCS似乎均影响位于脑干的呼吸神经元网络。cFOS数据提示，受影响的脑干呼吸结构局限于延髓腹侧部分，这与在人类中推定的电场向该区域扩散高度一致。tsDCS组在VLM中cFOS阳性神经元数量增加，提示腹侧呼吸群（ventral respiratory group）的活动增强；该功能实体包括吸气节律发生器pre-B?tzinger复合体。数据还提示，颈段阴极tsDCS增强了参与CO₂/H⁺化学敏感性的神经元群活动，即RTN，以及含有受酸中毒刺激5-羟色胺能神经元的RPa和ROb。无论是通过兴奋pre-B?tzinger复合体的吸气生成神经元或邻近神经元，还是通过兴奋在气体挑战时增强呼吸驱动的神经元，f_R和V_T均可能增加。值得指出的是，尽管分析专门针对呼吸网络结构，仍不能完全排除tsDCS诱导的cFos表达变化与其他生理效应相关。另一方面，在连合部/正中孤束核（commissural/median nucleus of the tractus solitarius, c/mNTS）中未观察到cFOS阳性细胞密度变化，这提示颈段阴极tsDCS并非通过调节上行神经通路影响呼吸控制。由于c/mNTS通过直接或间接整合来自感觉受体（如胸廓机械感受器或颈动脉分叉化学感受器）的信息而参与通气稳态，若这些神经通路信号增加，应导致c/mNTS中cFOS阳性神经元数量增加。然而，否定tsDCS通过调节上行感觉通路发挥通气效应的依据仅限于cFOS数据，因此这一问题仍需进一步研究。当然，对膈神经运动神经元（phrenic motoneurons）甚至膈神经本身的直接作用，也可能促成所观察到的V_T增加。至于对膈神经运动神经元的效应，可能涉及钙传导（calcium conductance）的调节，已有研究表明这一机制可参与阴极tsDCS对运动神经元的作用。

DCS诱导的弱电场通过何种细胞机制发挥作用，目前尚未得到完全阐明。然而，普遍接受的观点是，神经元静息膜电位的变化应对即时调节效应以及持续数分钟或数小时的后效应负责。这些效应可能涉及神经可塑性现象或神经炎症过程调节。与诱导神经可塑性过程的观点一致，尽管当前用于分析基因表达变化的方法仍属探索性，RNA-seq和RT-qPCR数据提示，先期即刻早期基因（immediate early genes）编码的转录因子表达受到调节，这些因子此前已被证实参与统筹构成神经元可塑性基础的基因表达变化，即Egr2、Egr4和Fosb。此外，RNA-seq数据提示，在延髓中，tsDCS诱导了直接参与GABA/GABA_A信号传导的基因（Car8、Gabra6、Gabrad）过表达。这一观察具有重要意义，因为GABA/GABA_A信号是中枢呼吸驱动形成与调节所涉及的信号通路之一，且近年来越来越多的动物和人体研究显示，DCS可诱导GABA能信号改变。另一方面，本研究数据并不支持tsDCS通过调节神经炎症过程对呼吸效应作出贡献，无论是通过刺激胶质细胞并促进促炎细胞因子产生，还是通过减少肥胖相关神经炎症。参与炎症过程的基因中，仅极少数受tsDCS调控；同时，在那些cFOS水平因tsDCS升高的呼吸相关结构中，小胶质细胞形态分析未见变化。

总之，本研究数据表明，颈段阴极tsDCS可改善模拟OHS的leptin缺陷小鼠的呼吸。其作用似乎同时涉及对呼吸网络结构的刺激以及神经可塑性过程的诱导。上述发现为一种用于治疗OHS患者低通气的全新非药物、无创治疗策略提供了概念验证。本研究也为在更广义的中枢性低通气综合征背景下应用该方法开辟了前景。未来仍需在雌性小鼠中开展研究，考察其他生理变量、长期效应可能持续的条件，以及细胞与分子过程，尤其需通过功能性验证，以全面评估该方法的转化潜力。

该研究发表于《Neuroscience Bulletin》，聚焦肥胖低通气综合征（Obesity Hypoventilation Syndrome, OHS）的中枢呼吸调控障碍及其潜在无创干预策略。OHS是肥胖相关神经呼吸疾病，临床上以肥胖、清醒高碳酸血症和睡眠呼吸障碍为特征，不仅显著增加心肺并发症和死亡风险，而且缺乏根治性治疗。既往认识认为，除肥胖造成的机械负荷外，中枢呼吸驱动受损在OHS发生中具有关键作用，并与中枢leptin抵抗相关。因此，寻找能够直接增强中枢呼吸网络活动的非药物干预，具有明确临床价值。研究人员此前已在健康人中发现，上颈段阴极经脊髓直流电刺激（trans-spinal direct current stimulation, tsDCS）可提高膈肌相关兴奋性并增加通气，由此提出该策略或可用于矫正中枢性低通气。基于这一背景，研究以Lep^ob/ob雄性小鼠为OHS前临床模型，检验上颈段无创经皮阴极tsDCS能否改善呼吸，并进一步解析其神经环路和分子基础。

从研究设计看，论文首先将既往用于人类的上颈段经皮tsDCS方案移植至成年小鼠，在C3/C5对应颈髓区域实施连续5 d刺激，并与假刺激组进行比较。结果显示，tsDCS可显著提高分钟通气量（minute ventilation, V?_E），其基础是呼吸频率（respiratory frequency, f_R）和潮气量（tidal volume, V_T）双重增加，其中f_R增幅更为持续。研究同时发现，tsDCS可减少小鼠处于SpO₂≤95%的低通气时间，提示这种呼吸促进效应具有生理获益。进一步的脑干功能组织学结果表明，tsDCS后延髓腹侧多个呼吸相关核团的cFos表达增强，包括疑核（Amb）、延髓腹外侧网状核（VLM）、后梯形核（RTN）、苍白中缝核（RPa）和隐中缝核（ROb），而脑桥内相关结构未见显著变化。结合RNA测序和RT-qPCR结果，研究提示tsDCS可诱导以Egr2、Egr4、Fosb等即刻早期基因为代表的神经可塑性反应，并可能影响GABA/GABA_A相关信号通路；相反，无论从炎症相关基因表达还是小胶质细胞形态学观察，均未获得明确神经炎症参与的证据。总体上，论文得出的核心结论是：上颈段阴极tsDCS能够在OHS样小鼠中增强通气、减少低通气，并伴随脑干呼吸网络激活及神经可塑性相关分子改变，从而为中枢性低通气的无创神经调控治疗提供了概念验证。

就研究必要性而言，现有OHS治疗主要依赖支持性策略，尤其是呼吸支持，但对中枢呼吸驱动异常本身缺乏直接修复手段。由于OHS病理中存在获得性中枢调控异常，且既往DCS研究已在运动、学习及神经康复领域证明其可塑性调节潜能，因此将tsDCS用于呼吸控制障碍具有扎实理论基础。该研究的重要意义在于，它将经脊髓直流电刺激从运动和感觉调节拓展到呼吸中枢调控领域，并首次在中枢性低通气模型中证明其可改善呼吸表型。这一结果不仅针对OHS具有潜在转化价值，也为更广义的中枢性低通气综合征干预打开了研究方向。

本研究主要采用以下关键技术方法：以雄性Lep^ob/ob小鼠建立肥胖相关中枢性低通气模型，实施连续5 d上颈段经皮阴极tsDCS，并设置假刺激对照；通过全身胸膜描记法评估f_R、V_T和V?_E，结合SpO₂监测评价低通气程度；采用cFos免疫组织学描记延髓和脑桥呼吸相关核团的神经元活动；对颈髓、延髓和脑桥进行RNA-seq，并以RT-qPCR验证关键基因表达变化；同时通过小胶质细胞形态学分析评估神经炎症是否参与该效应。

以下结合论文主体结果，按各部分核心内容进行解读。

一、Breathing in Lep^ob/ob mice modeling OHS following cathodal tsDCS targeting the upper cervical region of the spinal cord
该部分直接回答tsDCS是否改善OHS样小鼠呼吸这一首要问题。研究人员将刺激靶向上颈段脊髓后，利用胸膜描记和血氧监测动态观察5 d内通气变化。结果表明，tsDCS使Lep^ob/ob小鼠V?_E显著增加，这一增强由f_R和V_T共同驱动。其中，f_R自第1次刺激起即升高，并在多日刺激中持续维持；V_T亦在前4 d明显提高。与此同时，虽然平均SpO₂未显著上升，但小鼠处于SpO₂≤95%的时间缩短，提示低通气负担减轻。作者还指出，重复麻醉可能部分削弱了tsDCS的通气促进幅度，因此观察到的效应可能仍偏保守。该部分结论是：上颈段阴极tsDCS在OHS模型中具有明确的呼吸刺激作用，而且这种作用不仅体现在实验指标升高，更体现在低通气时段减少这一功能改善上。

二、Changes in c-Fos expression within the brainstem respiratory network concomitant with a phenomenon of neuroplasticity without neuroinflammatory processes in Lep^ob/ob mice submitted to cervical cathodal tsDCS
该部分从神经环路层面解释呼吸改善的来源。研究人员比较tsDCS组与sham组脑干呼吸相关区的cFos表达，发现变化主要集中于延髓腹侧，而非脑桥。具体而言，Amb、VLM、RTN、RPa、ROb等核团cFos阳性细胞显著增加。这些结构分别涉及吸气节律生成、呼吸驱动调节及CO₂/H⁺化学敏感性加工，因此结果支持tsDCS增强了脑干呼吸网络中与节律发生及化学驱动密切相关的神经元活动。尤其是VLM的激活，提示腹侧呼吸群可能被增强；RTN和中缝核群的激活，则提示对高碳酸/酸中毒敏感的呼吸促进通路可能被调动。相对地，脑桥相关区未见显著变化，说明此次刺激效应更集中于延髓腹侧网络。该部分建立了“tsDCS—脑干呼吸网络激活—通气增强”的功能联系。

三、RNA-seq analysis focused on cervical spinal cord, medulla oblongata, and pons
该部分从分子层面探索tsDCS作用机制。RNA-seq显示，tsDCS引起的差异表达基因数量并不多，但其中较大比例与神经可塑性密切相关。Egr2、Egr4、Fosb等即刻早期基因编码转录因子，已知参与神经元活动依赖性基因重编程和可塑性形成；Car8、Gabra6、Gabrad、Clic6涉及神经传递；Cbln3、Gh、En2则与神经元完整性、突触维持或神经环路稳定有关。RT-qPCR进一步证实，在颈髓中Egr2、Egr4、Fosb表达升高，在延髓中Egr4和Fosb表达升高。这说明tsDCS不仅在刺激部位诱导分子反应，也在下游呼吸整合中枢触发可塑性相关转录改变。研究还指出，延髓中GABA/GABA_A信号相关基因上调，提示抑制性神经传递调控可能参与呼吸网络重整。该部分的主要结论是：tsDCS伴随可检测的神经可塑性相关转录响应，这为其产生即时及后续呼吸调节效应提供了分子依据。

四、Morphological analysis of microglia and inflammatory-related findings
该部分主要检验神经炎症是否参与tsDCS引起的呼吸变化。研究针对cFos变化明显的呼吸相关核团，对小胶质细胞密度、分支数和分支长度进行了形态学分析，均未发现显著改变。与此一致，RNA-seq仅发现极少数炎症相关基因在颈髓、延髓或脑桥中发生调节，且未形成支持广泛炎症激活或抗炎重塑的整体证据。因此，论文认为当前数据不支持tsDCS通过诱导或缓解神经炎症来改善呼吸。该结果具有方法学意义，因为它将研究重点更明确地指向神经元活动增强和神经可塑性，而非胶质炎症介导机制。

从整体讨论来看，作者将本研究结果置于既有DCS研究框架中进行了谨慎解释。首先，tsDCS对呼吸的促进在健康WT小鼠中亦存在，与既往健康受试者研究一致，表明该效应并不依赖病理状态存在，但在低通气模型中具有更明确治疗价值。其次，f_R从首次刺激即增加，提示颈段阴极tsDCS可能较快作用于脑桥-延髓呼吸节律网络。作者结合既往电场建模文献认为，C3–C5水平tsDCS产生的电场可能沿脊髓-脑脊液导电路径纵向扩散至脑干，尤其影响延髓腹侧区域，这与本研究cFos定位结果高度一致。作者也讨论了另一种可能性，即通过上行感觉通路间接调节呼吸网络，但由于孤束核相关区未见cFos增加，这一解释暂未获得支持。另一方面，潮气量增加也不能排除存在对膈神经运动神经元的直接影响。关于机制层面，作者强调即刻膜电位变化可解释DCS的快速效应，而Egr2、Egr4、Fosb等可塑性标志物变化则支持其后续效应可能依赖活动依赖性转录调节。相较之下，神经炎症证据较弱，因此并非本研究所见呼吸改善的主要解释。

论文结论部分可译述为：研究数据表明，颈段阴极tsDCS能够改善模拟OHS的leptin缺陷小鼠的呼吸，其作用似乎同时涉及对呼吸网络结构的刺激和神经可塑性过程的诱导。这些发现为治疗OHS患者低通气提供了一种新的、非药物且无创的方法的概念验证，并为该策略在更广泛中枢性低通气综合征中的应用开辟了前景。

总体而言，这篇发表在《Neuroscience Bulletin》的研究在模型选择、功能评估、脑干环路解析和分子机制探索之间建立了较完整的证据链。其核心贡献并非提出已被完全验证的临床方案，而是在严格限定的前临床条件下证明：上颈段无创阴极tsDCS可以稳定增强通气、减少低通气时间，并与延髓腹侧呼吸网络激活及神经可塑性相关基因表达上调相伴随。对于OHS及其他中枢性低通气综合征而言，这一研究为神经调控治疗提供了新的实验依据和转化方向。