《Neurotoxicity Research》：Melatonin Modulates Behavioral and Physiological Responses in a Concentration-dependent Manner in a Pilocarpine-induced Seizure-like Model Using Zebrafish Larvae
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褪黑素因其抗氧化活性而被广泛研究，但其安全性和浓度依赖性效应仍仅被部分了解，特别是在水生实验系统中。在此，研究人员调查了褪黑素在毛果芸香碱（PILO）诱导的斑马鱼（Danio rerio）幼虫癫痫样模型中对行为和生理反应的影响。采用了一种多生物标志物框架，将受
褪黑素因其抗氧化活性而被广泛研究，但其安全性和浓度依赖性效应仍仅被部分了解，特别是在水生实验系统中。在此，研究人员调查了褪黑素在毛果芸香碱（PILO）诱导的斑马鱼（Danio rerio）幼虫癫痫样模型中对行为和生理反应的影响。采用了一种多生物标志物框架，将受精后144 h的胚胎-幼虫毒性评估与癫痫样活动相关的行为和生化终点相结合。在测试浓度范围（0.14–18 μg/mL）内，褪黑素不影响死亡率或孵化率。然而，暴露于较高浓度（9.0和18 μg/mL）导致自发收缩改变和胚胎心率增加，表明早期发育过程中可测量的生理变化。在较低浓度（2.25和4.50 μg/mL）下，褪黑素与减少PILO诱导的过度运动、增加癫痫样发作潜伏期以及减少向更严重行为阶段的进展相关。这些反应伴随着在72和144 hpf时活性氧（ROS）水平的降低。总体而言，数据揭示了一个浓度依赖性反应谱，不同暴露水平产生了不同的行为和生理结果。本研究有助于表征褪黑素在斑马鱼幼虫中的作用，并强调了在实验性癫痫模型中剂量选择的重要性。
癫痫是一种由异常神经元活动引起的复发性发作的慢性神经系统疾病，在全球范围内构成重大健康负担。实验动物模型在理解癫痫机制和识别候选抗癫痫化合物中发挥了核心作用。斑马鱼（Danio rerio）因其快速发育、高繁殖能力、保守的神经化学通路以及适用于高通量行为学和毒理学分析，逐渐成为癫痫研究中的重要替代模型。斑马鱼幼虫能够在完整生物体中同时研究行为、生理和发育反应，为转化神经药理学研究提供了有价值的平台。在癫痫诱导方案中，戊四氮（PTZ）因其能产生稳健且可重复的癫痫样表型而被广泛使用，但其机制主要与GABA能抑制阻断相关，可能无法充分复制与胆碱能过度兴奋相关的机制。毛果芸香碱（PILO）作为一种毒蕈碱型胆碱能激动剂，可通过激活不同的神经元通路诱导癫痫发作，在啮齿动物模型中常用于研究颞叶癫痫和癫痫发生，重现了人类癫痫的多种行为和神经病理学特征。尽管在斑马鱼中也有胆碱能诱导癫痫的报道，但基于PILO的研究仍远少于PTZ方法。现有证据表明，PILO暴露可诱导斑马鱼幼虫产生特征性癫痫相关反应，包括过度运动、震颤、甩尾和姿势控制障碍，但整合癫痫相关行为改变与发育毒性终点的研究仍然有限。褪黑素是一种内源性吲哚胺，以其在昼夜节律调节和抗氧化防御机制中的作用而闻名。越来越多的证据表明，褪黑素可通过减少癫痫发作严重程度、氧化失衡和神经元损伤，在实验性癫痫模型中发挥神经保护作用。然而，关于其浓度依赖性效应的文献仍不明确，较低浓度常报告保护性反应，而较高暴露则与生理和发育紊乱相关。此外，大多数研究集中在PTZ诱导模型，而基于胆碱能诱导的剂量依赖性效应在斑马鱼中仍未得到充分表征。因此，本研究旨在评估褪黑素在毛果芸香碱诱导的斑马鱼（D. rerio）幼虫癫痫样模型中的毒性和抗癫痫作用，研究在两个不同发育阶段（72和144 hpf）进行，假设褪黑素在较低浓度下发挥浓度依赖性神经保护和抗惊厥作用，而较高浓度可能导致可测量的神经发育毒性。本研究发表在《Neurotoxicity Research》。
研究人员采用了以下主要关键技术方法：首先，根据OECD指南第236号进行斑马鱼胚胎-幼虫毒性测试（ZELT），评估褪黑素（0.14–18 μg/mL）对胚胎-幼虫死亡率和孵化率的影响。其次，在24 hpe评估自发收缩频率（每分钟运动次数）作为神经毒性指标，在48 hpe评估心率（每分钟心跳次数）作为心脏毒性指标。第三，在抗癫痫发作评估中，研究人员在72和144 hpf两个时间点，将幼虫分为阴性对照组、PILO组、PILO联合褪黑素（2.25和4.50 μg/mL）组、溶剂对照组及溶剂+PILO组，采用基于Matlab的Zebtrack软件进行运动追踪，分析总运动距离，并使用BORIS软件评估癫痫发作潜伏期和阶段评分。第四，采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针测定活性氧（ROS）水平，以相对荧光单位/蛋白质含量表示。样本队列来源：斑马鱼成鱼来自实验室养殖系统，胚胎取自15尾成鱼（2:1雄雌比），幼虫在约2 hpf时筛选并随机分配至各组。
研究结果如下：
**死亡率与孵化率**：通过24至144 hpf的每日死亡率监测和96 hpf的最终孵化率评估，发现褪黑素在0.14–18 μg/mL范围内未显著改变胚胎-幼虫死亡率或孵化率（p > 0.05），与阴性对照组相比无差异。阳性对照组（二氯苯胺）则引起完全死亡率和孵化率降低，验证了实验系统的敏感性。
**神经毒性与心脏毒性**：在24 hpe，较高浓度褪黑素（9.0和18 μg/mL）显著降低自发收缩频率（p < 0.05），表明对早期神经运动活动的干扰；较低浓度无显著影响。在48 hpe，最高浓度（18 μg/mL）导致心率增加（p < 0.05），而较低浓度未见显著变化或呈降低趋势，提示褪黑素对心脏生理的浓度依赖性效应。
**行为评估**：在72 hpf，褪黑素预处理（2.25和4.50 μg/mL）显著减少PILO诱导的过度运动，总运动距离与阴性对照组和溶剂对照组接近（p < 0.05）。在144 hpf观察到类似模式，褪黑素预处理显著减轻PILO诱导的过度运动（p < 0.05）。此外，褪黑素还显著缩短了癫痫发作阶段持续时间，减少了发作次数，并增加了非发作行为（评分0）的持续时间（p < 0.0001）。褪黑素也增加了癫痫发作的潜伏期，且较高浓度在144 hpf限制了向更严重发作阶段的进展。
**ROS水平**：在72和144 hpf，褪黑素预处理（2.25和4.50 μg/mL）均显著降低PILO诱导的ROS水平（p < 0.05），与阴性对照组水平相当，表明褪黑素减轻了PILO相关的氧化应激。
讨论部分总结：本研究在斑马鱼幼虫毛果芸香碱诱导的癫痫样模型中评估了褪黑素的毒理学和行为效应。在实验条件下，褪黑素在2.25和4.50 μg/mL下未检测到发育毒性，并伴随PILO诱导条件下癫痫样行为反应减少和ROS水平降低，且效应在72和144 hpf一致。死亡率和孵化率无显著影响与先前研究一致，但较高浓度下自发收缩减少和心率增加表明褪黑素暴露可诱导早期发育中的浓度依赖性生理紊乱，强调了剂量选择的重要性。在PILO诱导条件下，褪黑素预处理减轻了过度运动、延迟了发作起始并限制了向更严重阶段的进展，这与斑马鱼和哺乳动物癫痫模型中的发现相似，支持褪黑素在化学诱导癫痫条件下调节癫痫相关过程的假说。由于胆碱能癫痫模型在斑马鱼中研究较少，本研究扩展了褪黑素在替代癫痫背景下的剂量依赖性证据。ROS降低与褪黑素的抗氧化特性一致，但需谨慎解释，因为氧化应激减少可能源于直接抗氧化作用、神经元过度活跃降低的间接后果或两者相互作用。由于未进行分子、受体和电生理学分析，本研究结果不允许对机制进行推断，仅支持行为学和生化关联。此外，未包含褪黑素单独组是本研究的一个局限性，因为实验设计旨在研究褪黑素对PILO诱导行为的调节，而非其单独效应。最后，研究结论翻译如下：褪黑素在暴露于毛果芸香碱的斑马鱼幼虫中产生浓度依赖性效应，不同暴露水平下出现不同的行为和生理结果。较低浓度与减少PILO诱导的癫痫样行为反应和降低ROS水平相关，而较高浓度与早期发育过程中可测量的生理变化相关。这些反应的强度也随发育阶段而变化，表明暴露水平和发育阶段均影响观察到的结果。总之，这些发现有助于当前关于斑马鱼癫痫样模型中褪黑素反应的证据，并进一步支持使用斑马鱼幼虫研究早期发育中的神经活性化合物。尽管本研究展示了一致的行为和生化反应，但仍需整合电生理学、分子和组织特异性氧化应激分析的进一步研究，以阐明褪黑素在胆碱能癫痫模型中的神经保护机制。
