日本濒危啮齿动物中分离到耐药铜绿假单胞菌

《EcoHealth》：Isolation of Drug-Resistant Pseudomonas aeruginosa from a Species of Endangered Rodent in Japan

　　

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）是一种广泛分布于环境中的机会性病原体，但其在野生动物中的出现情况仍知之甚少。研究人员从一只琉球群岛树鼠（Diplothrix legata）的肺中分离到P. aeruginosa，该树鼠是在世界自然遗产地“山原森林”附近被救获的。药敏试验显示，该分离株对三种氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones）耐药，基因组分析表明该分离株携带共计61个耐药基因。本研究首次在日本野生动物中分离到耐药P. aeruginosa，表明有必要通过耐药细菌进行环境抗菌药物耐药性（AMR）监测。

**论文解读：日本濒危啮齿动物中耐药铜绿假单胞菌的分离与基因组特征**

**研究背景与问题**
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）是一种革兰阴性杆菌，广泛存在于环境中，作为机会性病原体常在医院内引发感染。其主要特征之一是易于获得多重抗生素耐药性。在日本法律中，对至少三种抗生素（广谱β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类）获得耐药性的P. aeruginosa被定义为多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug-resistant P. aeruginosa，MDRP），在医院环境中构成重大威胁。尽管P. aeruginosa常见于环境，并经常从伴侣动物和家畜中分离到，但有关野生动物中分离出P. aeruginosa的报道甚少，且分离到的菌株具有耐药性的报道更是罕见。琉球群岛树鼠（Diplothrix legata）是日本特有啮齿动物，仅分布于日本西南诸岛，为濒危IB类物种，其数量因环境破坏和入侵物种（如狗、猫、猫鼬）的捕食而下降。研究人员通过回收死亡野生动物以确定死因并保护遗传资源。本研究从一只出现肺炎样症状后死亡的琉球群岛树鼠的肺中分离到P. aeruginosa，并对其进行了遗传特征分析和耐药性评估。

**研究目的与结论**
本研究旨在从一只濒危野生动物中分离P. aeruginosa，并鉴定其耐药表型和基因组特征。结论如下：该分离株（命名为Kenaga1株）对三种氟喹诺酮类药物（恩诺沙星、奥比沙星、环丙沙星呈中介耐药）耐药，但不符合MDRP定义；基因组分析显示其携带61个耐药基因，并具有多种毒力基因（如ExoS、ExoT、ExoY、toxA、lipA、磷脂酶C），提示对人类也具有致病潜力；该菌株序列型为ST274，在日本临床分离株中较为罕见，但表明人类临床来源的序列型也可能存在于野生动物群体中。该研究首次在日本野生动物中分离到耐药P. aeruginosa，且发现地点靠近世界自然遗产地“山原森林”，凸显了在野生动物和环境健康中考虑抗菌药物耐药性的必要性。论文发表在《EcoHealth》。

**主要技术方法**
研究人员采用病理学检查（苏木精-伊红染色，H&E染色）对10%福尔马林固定的肺组织进行观察；细菌分离使用萘啶酸-三甲铵溴化铵（NAC）琼脂培养基，并通过API 20NE系统鉴定为P. aeruginosa；药敏试验采用纸片扩散法，参照CLSI M100-Ed32指南；全基因组测序结合Nanopore Flongle和Illumina MiSeq平台，使用Unicycler进行混合组装；耐药基因和毒力基因分析通过DFAST、pubMLST和CARD数据库完成，并与PAO1菌株（GenBank登录号：NC_002516.2）和MDRP NCGM1984菌株（登录号：NZ_AP014646.1）进行比较。样本来源为2023年1月18日在冲绳县山原国立公园附近发现的一只衰弱琉球群岛树鼠。

**研究结果**
**病理学检查结果**：H&E染色显示肺组织存在广泛急性或亚急性炎症病变，支气管腔内可见变性炎性细胞和杆状细菌集落，提示该鼠死于严重细菌性肺炎。

**细菌学试验结果**：从肺组织中分离出P. aeruginosa（Kenaga1株），通过API 20NE确认。病理和细菌学结果共同表明死因为P. aeruginosa感染所致肺炎。

**药敏试验结果**：对13种抗生素进行药敏试验，显示对恩诺沙星和奥比沙星耐药，对环丙沙星中介耐药。该菌株不属于MDRP（因未同时对β-内酰胺类和氨基糖苷类耐药），但为耐药性P. aeruginosa。由于救获后使用恩诺沙星治疗无效，推测该菌株原本即对恩诺沙星耐药，而非因治疗获得新耐药性。

**基因组分析结果**：全基因组测序获得约6.3 Mbp的完整染色体和约73 kbp的质粒序列，提交至DDBJ（登录号：AP031457-AP031458）。pubMLST分析显示该菌株序列型为ST274，与日本临床分离株中占主导的ST235不同，仅有两株ST274的报道。毒力基因检测显示Kenaga1株携带ExoS、ExoT、ExoY（诱导细胞凋亡）、toxA（抑制蛋白质合成导致细胞死亡）、lipA（损伤肺组织）和磷脂酶C（减少肺泡表面活性物质诱导肺炎）等主要毒力基因，这些基因也常见于人源菌株。耐药基因分析显示，Kenaga1株染色体编码61个耐药基因，而PAO1和NCGM1984分别携带58和67个耐药基因。与MDRP NCGM1984相比，Kenaga1株缺失aadA6（氨基糖苷类耐药）、IMP-34（β-内酰胺类耐药）和sul1（磺胺类耐药）基因，与其对氨基糖苷类、β-内酰胺类和磺胺类敏感的表型一致。有趣的是，Kenaga1株虽携带磷霉素耐药基因FosA，但表型为磷霉素敏感；超过99%的P. aeruginosa染色体上编码FosA，但仅约70%的MDRP实际耐磷霉素，提示该菌株可能具有潜在耐药性。Kenaga1株与另两株菌的OXA和PDC基因（编码β-内酰胺酶）存在差异，表明其可能对β-内酰胺类抗生素耐药。此外，Kenaga1株和NCGM1984均携带basR（诱导多黏菌素耐药）、MexT（正调控外排泵导致多重耐药）以及氟喹诺酮类耐药相关的gyrA基因T83I突变，提示该菌株可能对未测试的其他抗生素也具有耐药性。

**总结讨论与结论**
本研究首次在日本野生动物中分离到耐药P. aeruginosa。发现地点靠近世界自然遗产地“山原森林”，这一发现强调了对野生动物和环境健康中抗菌药物耐药性（AMR）进行监测的必要性。目前尚无关于冲绳北部山原森林地区或附近区域从野生动物或环境来源分离P. aeruginosa的可比报告，这限制了区域解读。由于氟喹诺酮类为合成抗菌药物，检测到氟喹诺酮耐药P. aeruginosa可能提示其暴露于人为抗菌药物选择压力，但不能排除环境中先前存在的耐药菌株持续存在。未来研究应通过系统尸检、组织病理学检查和受影响组织的细菌培养评估P. aeruginosa是否导致野生动物死亡。此外，研究人员已启动使用水样环境DNA宏基因组分析对山原森林进行环境监测，以评估当地抗菌药物耐药基因的分布。研究结论：本研究首次在日本野生动物中分离到耐药P. aeruginosa，表明有必要通过耐药细菌进行环境抗菌药物耐药性监测。