在北海和波罗的海沿岸死亡的港湾鼠海豚中检测到鼠海豚瘟病毒和中和抗体

《Transboundary and Emerging Diseases》：Detection of Phocoena Pestivirus and Neutralizing Antibodies in Harbor Porpoises Found Dead at the North Sea and Baltic Sea Coasts

　　

2019年，一种海洋瘟病毒，鼠海豚瘟病毒（Phocoena pestivirus, PhoPeV），属于瘟病毒科（Pestiviridae），首次被描述。迄今为止，PhoPeV感染对港湾鼠海豚的影响仍未知。因此，研究人员对2021–2025年间在德国北海和波罗的海沿岸死亡的港湾鼠海豚进行了筛查研究。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对84只港湾鼠海豚的器官样本进行分析，结果显示5只动物（5.9%）的样本中存在PhoPeV RNA。从其中两个样本中分离出感染性病毒。系统发育分析显示与先前报道的PhoPeV分离株关系密切。此外，研究人员建立了一种病毒中和试验，使用器官液体和器官匀浆基质代替标准血清样本基质。在72只动物的样本中，有7只检测出针对PhoPeV的中和抗体阳性，其中4份样本的抗体滴度≥320 ND₅₀。交叉中和研究包括经典猪瘟病毒（CSFV）、边界病病毒（BDV），以及Bungowannah瘟病毒（BuPV）和Linda病毒（LindaV），这两种病毒与PhoPeV亲缘关系最近，结果显示与PhoPeV无显著血清学相关性。总之，过去5年在北海和波罗的海发现的死亡动物中检测到了PhoPeV RNA和针对PhoPeV的中和抗体，表明PhoPeV至少在港湾鼠海豚种群中持续循环了数年。

该研究发表在《Transboundary and Emerging Diseases》，聚焦于北海和波罗的海沿岸死亡的港湾鼠海豚（Phocoena phocoena）中鼠海豚瘟病毒（Phocoena pestivirus, PhoPeV）的检测与血清学特征。研究人员首先阐述了研究背景：瘟病毒科（Pestiviridae）包括多种重要病原，如经典猪瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹泻病毒-1（BVDV-1）等。2019年，首个海洋瘟病毒PhoPeV在港湾鼠海豚中被发现，但其对宿主健康的影响、传播模式（特别是是否存在垂直传播导致持续感染）以及宿主范围仍不清楚。此前仅有两项研究通过基因组检测调查了PhoPeV在北海和波罗的海的流行率（分别为9%和1.3%），但缺乏血清学证据。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过基因组和抗体检测揭示PhoPeV的持续循环情况，并建立替代血清的抗体检测方法。

研究人员对2021–2025年间在德国北海和波罗的海沿岸死亡的84只港湾鼠海豚进行了分析。主要结论包括：5只动物（5.9%）的器官样本中检出PhoPeV RNA，从中分离出两株感染性病毒，系统发育分析显示其与先前报道的分离株高度相似；首次建立使用器官液体或器官匀浆基质的病毒中和试验（VNT），在72只动物样本中检出7份针对PhoPeV的中和抗体阳性，其中4份抗体滴度≥320 ND₅₀；交叉中和试验表明，PhoPeV与经典猪瘟病毒（CSFV）、边界病病毒（BDV）、Bungowannah瘟病毒（BuPV）及Linda病毒（LindaV）无显著血清学相关性，但一高滴度抗体样本对LindaV有部分中和（滴度120 ND₅₀）。这些结果证实PhoPeV在过去5年间持续在港湾鼠海豚种群中循环，且建立的VNT可为血清学监测提供有效工具，但不同瘟病毒间的抗原关系仍需进一步研究。

**主要关键技术方法**：样本队列来源于德国汉诺威兽医大学陆生和水生野生动物研究所（ITAW）及下萨克森州消费者保护与食品安全局（LAVES），共84只港湾鼠海豚（44只来自波罗的海，30只来自北海，10只来自易北河河口）。主要方法包括：使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测器官（肺和脑）匀浆中的PhoPeV RNA；通过接种猪肾细胞系SK6进行病毒分离，并用免疫过氧化物酶染色检测病毒抗原；基于器官液体或匀浆建立VNT，以替代血清样本，检测中和抗体；针对PhoPeV E2蛋白编码区进行测序和系统发育分析（最大似然法，JTT模型）；交叉中和试验使用CSFV、BDV、BuPV及LindaV毒株，评估血清学相关性。

**研究结果**：
**3.1 港湾鼠海豚中PhoPeV的检测、病毒分离及系统发育分析**：通过对84只港湾鼠海豚器官样本的RT-PCR分析，5只动物（5.9%）检出PhoPeV RNA，其中2只来自北海（1雌1雄），3只来自波罗的海（均为雌性）。从2只Cq值<27的北海样本中分离出感染性病毒，而Cq值≥36的样本未分离成功。新分离株的基因组均缺失Npro编码区，与已知PhoPeV特征一致。对3只RNA阳性样本的完整E2编码区进行测序（GenBank：PX128140-42），系统发育分析显示这些分离株与先前报道的PhoPeV毒株亲缘关系密切，其中2023年的一株与北海分离株聚类。

**3.2 检测针对PhoPeV的中和抗体**：研究人员建立了使用器官液体或匀浆的VNT。对72只动物的器官样本检测，其中23份可获取器官液体。由于细胞毒性，器官液体从1:20稀释度开始检测，器官匀浆从1:5开始。结果：7份样本检出中和抗体阳性（≥10 ND₅₀），包括6份器官液体样本（抗体滴度80–1920 ND₅₀）和1份来自无器官液体样本的匀浆（滴度20 ND₅₀）。其中4份抗体滴度≥320 ND₅₀。器官匀浆的抗体滴度较器官液体低至多10倍，可能因稀释效应。所有抗体阴性样本在VNT中均未出现特异性中和。值得注意的是，一份RNA阳性样本（P.p. 5）同时检出高滴度抗体（1920 ND₅₀），提示可能处于急性感染后期。

**3.3 PhoPeV与其他瘟病毒的抗原相关性**：交叉中和试验包含PhoPeV、CSFV（Alfort/187和Diepholz）、BDV Frijters、BuPV及LindaV。结果显示，所有CSFV、BDV及BuPV的阳性血清均不能中和PhoPeV，反之亦然。LindaV抗血清对PhoPeV亦无中和。但动物P.p. 5的器官液体（抗PhoPeV滴度1920 ND₅₀）在LindaV VNT中检出滴度120 ND₅₀，提示可能存在部分交叉反应。其他抗体阳性样本均无交叉中和。

**讨论与结论**：讨论部分指出，PhoPeV RNA检出率（5.9%）与先前报道的北海（9%）和波罗的海（1.3%）流行率相符，表明病毒持续循环。新分离株的E2序列高度相似，支持病毒相对稳定存在。器官液体和匀浆作为VNT替代基质有效，但灵敏度较低，且需注意细胞毒性干扰。7份抗体阳性样本中，6份RNA阴性，提示这些动物曾感染并清除病毒，可能产生保护性免疫；1份RNA与抗体双阳性（P.p. 5）可能处于急性感染后期；而4份RNA阳性但抗体阴性样本（包括两株分离出病毒）可能处于早期急性感染或为持续感染（PI）动物。由于缺乏纵向数据，无法区分急性与持续感染，但多年持续检出基因组提示PI可能在港湾鼠海豚种群中存在。交叉中和试验表明PhoPeV与CSFV、BDV、BuPV无抗原相关性，但与LindaV存在部分交叉，尽管LindaV抗血清不能中和PhoPeV，提示抗原差异显著。

研究结论部分翻译如下：总之，本研究的结果进一步揭示了PhoPeV的分布，表明其在北海和波罗的海区域的港湾鼠海豚种群中持续循环。此外，使用替代样本基质建立的PhoPeV特异性VNT为PhoPeV的分布以及病毒与宿主在体液免疫应答方面的相互作用提供了新的理解。对其他鲸类物种和栖息地的进一步筛查，以及港湾鼠海豚细胞系的建立，将扩展对PhoPeV影响港湾鼠海豚种群的认识。