《Aging Cell》：Neutrophil Extracellular Traps Exacerbate UVB-Induced Photodamage in HaCaT Cells and Mouse Skin via CCDC25/MAPK Pathway
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皮肤光损伤的发病机制尚未完全阐明。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）被认为可加剧皮肤光损伤，但其精确机制仍需进一步研究。研究人员在光线性皮肤病（Actinic Dermatosis）患者皮肤组织中通过免疫荧光检测到NETs。体内实验中，采用UVB照射建立急性光损
皮肤光损伤的发病机制尚未完全阐明。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）被认为可加剧皮肤光损伤，但其精确机制仍需进一步研究。研究人员在光线性皮肤病（Actinic Dermatosis）患者皮肤组织中通过免疫荧光检测到NETs。体内实验中，采用UVB照射建立急性光损伤小鼠模型，并给予PAD4抑制剂GSK484处理，结合RNA测序探究NETs促进炎症与凋亡的机制；检测了NETs含量、丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性。体外实验中，以NETs处理永生化角质形成细胞（HaCaT细胞），测定细胞活力、活性氧（ROS）水平、炎症细胞因子释放、凋亡、SOD生成及MDA水平；敲低25次跨膜蛋白（CCDC25）以验证其作为NETs在HaCaT细胞中关键受体的作用。结果显示，光线性皮肤病患者皮肤中存在大量NETs；GSK484注射显著减轻小鼠UVB诱导的皮肤损伤、炎症及细胞凋亡；RNA测序揭示PAD4缺失抑制UVB诱导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活；NETs处理诱导HaCaT细胞凋亡、抑制活力、促进炎症因子释放并破坏氧化还原稳态，同时升高磷酸化Jun氨基末端激酶（p-JNK）活性，而CCDC25敲低可抑制该活性并恢复细胞状态。综上，NETs通过CCDC25激活p-JNK/JNK通路加剧皮肤光损伤，导致HaCaT细胞凋亡、活力抑制及炎症因子释放。
研究背景与立项依据
皮肤直接暴露于外界环境，UVB（280–320 nm）辐射可引发DNA链损伤、氧化应激、炎症与细胞凋亡，并激活MAPK与NF-κB等信号级联，慢性暴露还可致光老化与癌变。中性粒细胞在UV诱导的光损伤中发挥重要作用，其释放的网状结构NETs由DNA与蛋白组成，PAD4介导的组蛋白H3瓜氨酸化（CitH3）是NETs形成的关键。既往研究提示抑制NETs可减轻UVB光损伤，但NETs作用于角质形成细胞的具体受体与下游通路不清。CCDC25作为NETs-DNA受体已在肿瘤细胞、成纤维细胞中被报道，其在角质形成细胞光损伤中的角色未知。该研究发表于《Aging Cell》，旨在明确NETs经CCDC25/MAPK轴加剧UVB光损伤的机制，为靶向NETs或CCDC25的治疗提供依据。
主要关键技术方法
研究纳入10例光线性角化病（AK）或慢性光线性皮炎（CAD）患者皮损与5例健康人非曝光区皮肤作对照；采用C57BL/6J雄性小鼠建立UVB（430 mJ/cm2，连续2天）急性光损伤模型，设对照组、GSK484组、UVB组及UVB+GSK484组，部分实验用PAD4敲除鼠及局部皮肤注射AAV-shCCDC25敲低鼠；从人外周血分离中性粒细胞以PMA/离子霉素/UVB诱导NETs，提取后干预HaCaT细胞；体内外分别用GSK484抑PAD4、DNase I降解NETs-DNA、siRNA敲低CCDC25；结合RNA测序、KEGG/GO富集、Western Blotting检测MAPK分支（JNK/p38/ERK）磷酸化、凋亡蛋白（BAX/BCL-2/Cleaved Caspase-3）、CCDC25，流式与TUNEL/Cleaved Caspase-3共染评凋亡，CCK-8测活力，荧光探针定ROS，试剂盒定MDA/SOD，qPCR定炎症因子（TNF-α/IL-1β/IL-6等）。
研究结果
3.1 光性皮炎皮损NETs增多
免疫荧光（CitH3+NE共定位）显示AK/CAD患者皮损NETs沉积显著高于健康皮肤，H&E见表皮增厚，证实UV暴露促中性粒细胞浸润与NETs形成。
3.2 NETs抑制缓解小鼠UVB光损伤
GSK484腹腔注射降低小鼠皮炎评分，减轻红斑渗出；H&E示表皮增厚改善；皮肤MDA下降、SOD上升；TNF-α/IL-1β/IL-6 mRNA回降；IF示NETs沉积减少；PAD4敲除鼠表型一致。表明NETs加剧损伤，抑NETs可缓解。
3.3 GSK484改善光损伤小鼠细胞凋亡
TUNEL+Cleaved Caspase-3共染阳性率下降；WB示Cleaved Caspase-3与BAX下调、BCL-2上调。抑NETs减轻角质/成纤维样细胞凋亡。
3.4 GSK484经MAPK通路缓解损伤
RNA测序WB vs WC获6409差异基因，PB vs WB获78个；KEGG富集下调基因落于MAPK与Hippo等通路；WB证实NETs存在时p-JNK/JNK升高，GSK484仅抑p-JNK/JNK（不影响p-p38/p38、p-ERK/ERK）。NETs经p-JNK/JNK促凋亡。
3.5 DNase I阻断NETs对HaCaT的抑制效应
体外UVB诱导中性粒细胞释NETs（4000 ng/mL最优），DNase I预处理恢复HaCaT增殖（CCK-8），下调IL-1α/IL-1β/TNF-α/IL-6 mRNA，降ROS与MDA、升SOD，逆转氧化还原失衡与炎症。
3.6 DNase I抑NETs凋亡 via 阻p-JNK/JNK
流式示NETs促HaCaT凋亡，DNase I rescue；WB示NETs特异升p-JNK/JNK及BAX/Cleaved Caspase-3、降BCL-2，p38/ERK分支未变。NETs经p-JNK/JNK促角质细胞凋亡。
3.7 敲低CCDC25阻断NETs/p-JNK/JNK/凋亡
qPCR/WB示NETs刺激后CCDC25上调最显著（高于TLR族）；siRNA敲低CCDC25后，NETs不再激活p-JNK/JNK，凋亡蛋白谱恢复正常，炎症改善。CCDC25是NETs在HaCaT的关键受体。
3.8 皮内AAV-shCCDC25缓小鼠光损伤
小鼠背部皮注AAV-shCCDC25 3周后CCDC25蛋白降；UVB造模后红斑渗出轻于shNC组，表皮薄、MDA降SOD升，p-JNK/JNK与凋亡蛋白下调，炎症因子mRNA回降。体内印证CCDC25为NETs促损伤关键靶。
讨论与结论翻译
讨论指出，UVB直接/间接致皮肤细胞凋亡、氧化还原紊乱与炎症；NETs在感染与非感染性疾病中具双刃剑作用，GSK484抑PAD4减NETs已成策略。RNA测序锁定MAPK中仅p-JNK/JNK分支被NETs调控。CCDC25既往知为肿瘤/成纤维细胞NETs-DNA受体，本研究发现其在角质细胞受NETs后显著上调，siRNA与AAV敲低均阻断p-JNK/JNK激活与损伤表型，确立NETs–CCDC25–p-JNK/JNK轴。
结论：NETs可加剧UVB诱导皮肤光损伤；GSK484通过抑制NETs生成减轻小鼠UVB光损伤；NETs经CCDC25激活p-JNK/JNK信号通路，促进角质形成细胞凋亡、抑制活力并释放炎症细胞因子，从而加剧皮肤光损伤。
