Spatialproteomics：一种用于分析高多重荧光图像数据的可互操作工具箱

《Nature Methods》：Spatialproteomics: an interoperable toolbox for analyzing highly multiplexed fluorescence image data

　　

高多重免疫荧光成像以低成本和高度可扩展性在完整组织中实现单细胞分辨率下的蛋白质水平可视化和定量。分析这些数据涉及多个步骤，需要根据数据和分析目标调整许多方法和参数选择。目前缺乏一个能够提供灵活端到端工作流覆盖的工具箱。研究人员在此介绍‘spatialproteomics’，一个解决这些挑战的Python包。Spatialproteomics能够处理和分析大型成像数据，包括分割、图像处理和细胞类型分类等步骤，同时同步不同数据模态之间的共享坐标。研究人员在来自132名患者的反应性淋巴结和B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphomas, BNHL）图像上展示了spatialproteomics。研究人员展示了从原始图像到统计表征的端到端分析，揭示细胞类型组成和空间分布在惰性和侵袭性淋巴瘤之间的差异。此外，研究人员展示了spatialproteomics如何处理十亿像素（Gigapixel）全切片图像。

**空间蛋白质组学工具包Spatialproteomics的论文解读**

**研究背景与问题**
空间蛋白质组学技术，如共检测索引（CODEX）、MACSima成像循环染色（MICS）或成像质谱流式（IMC），能够在单细胞分辨率下对组织进行高多重分子和形态学分析，兼容福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，已在肿瘤微环境（TME）研究中广泛应用。然而，这些技术生成的多通道图像数据分析流程复杂，涉及细胞分割、图像处理、蛋白质定量和细胞表型分类等多个步骤，且需要根据数据和分析目标定制参数选择。目前缺乏一个提供灵活端到端覆盖、同步各数据模态共享坐标的统一工具箱，这成为阻碍大规模空间蛋白质组学分析的主要瓶颈。

**研究内容与意义**
研究人员开发了Python包“spatialproteomics”，旨在解决上述挑战。该工具基于xarray数据结构，提供一致的数据表示，支持分割、图像处理、标记量化、细胞类型分类、邻域分析和可视化等功能的端到端流程，并通过Dask实现并行处理大尺度过内存数据集。在132例B细胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL）患者及非肿瘤对照的淋巴结活检样本（包括组织微阵列（TMA）和全切片图像（WSI））上，研究人员展示了从原始图像到统计表征的完整分析，揭示了细胞类型组成和空间分布在惰性与侵袭性淋巴瘤间的差异，并验证了处理十亿像素级全切片图像的能力。该研究发表于《Nature Methods》，为空间蛋白质组学分析提供了可互操作、模块化的开源工具，促进了与scverse生态系统的集成，为多模态空间组学研究开辟了新途径。

**关键技术方法**
研究主要采用以下关键技术：1）基于xarray的数据结构，同步共享维度（如空间坐标、细胞实例），确保图像、分割掩膜和表达矩阵的一致性；2）集成预训练神经网络（stardist、mesmer、cellpose）进行细胞分割，支持多标记独立分割后合并；3）图像处理工具（阈值化、滤波、形态学操作）提升信噪比；4）细胞类型分类通过层次化门控树（决策树）实现，基于手动阈值化后最大标记表达分配，也可使用概率方法（astir）；5）邻域分析通过Delaunay三角剖分或固定半径定义邻域，利用k-means聚类识别典型邻域模式；6）空间统计方法包括Ripley's K函数、Cross-K函数和squidpy邻域富集评分；7）与anndata和spatialdata格式的数据互操作，支持集成到scverse生态。样本队列来源：132例BNHL患者（包括惰性：边缘区淋巴瘤（MZL）和滤泡性淋巴瘤（FL）；侵袭性：弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（PMBCL）、伯基特淋巴瘤和B细胞淋巴母细胞淋巴瘤（BLBL））及非肿瘤对照的反应性淋巴结，共250个TMA核心（直径1 mm）和5个全切片图像。

**研究结果**

**Spatialproteomics简化了高多重荧光图像的处理**
研究人员设计了spatialproteomics的数据结构，基于xarray实现共享维度同步，允许函数链式调用（endomorphism设计模式），无需中间变量。该工具提供分割（stardist、mesmer、cellpose）、图像处理（阈值化、滤波等）、表达矩阵计算（均值、中位数等）、细胞类型分类（决策树或astir方法）及层次化门控树（支持布尔组合标记）的功能。通过Dask并行化处理大尺度数据集，并以zarr格式存储，支持内存高效加载。与scverse生态（anndata、spatialdata）的互操作促进了与squidpy、SCIMAP等下游分析工具的集成。

**B细胞非霍奇金淋巴瘤数据的示例分析**
研究人员对132例患者的淋巴结活检样本（TMA核心）进行分析，构建了层次化门控树，将细胞类型分为T细胞（CD3⁺）、B细胞（PAX5⁺）、巨噬细胞（CD68⁺）等主要类型，并进一步细分亚型（如细胞毒性T细胞（Ttox）、滤泡辅助T细胞（TFH）等）。通过比较三组（反应性淋巴结、惰性淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤）的细胞类型组成，发现侵袭性淋巴瘤中B细胞含量显著增加，巨噬细胞和基质细胞增多，细胞面积更大（与母细胞形态一致）。邻域分析（k-means聚类，k=7）识别出7种典型邻域，包括B细胞富集区、增殖B细胞（Bprol）/TFH细胞富集区、髓系/巨噬细胞区等。线性判别分析（LDA）显示从反应性淋巴结到惰性至侵袭性淋巴瘤的清晰轨迹，其中同质性（homophily，同类细胞比例）是关键区分特征，表明扩散性结构在侵袭性淋巴瘤中更常见。

**空间统计揭示细胞类型间的空间关联**
研究人员使用Ripley's K函数（≤150 μm）分析细胞聚集性，发现反应性淋巴结中B细胞、Bprol细胞和TFH细胞在生发中心内聚集，而侵袭性淋巴瘤中聚集减弱。通过squidpy的邻域富集评分（<70 μm）发现，在粗细胞类型水平上，空间结构随淋巴瘤侵袭性增加而消失。进一步使用Ripley's Cross-K函数分析细粒度细胞类型对，发现反应性淋巴结中多种细胞类型（如B细胞间、Bprol与TFH细胞间）存在显著空间关联，而在侵袭性淋巴瘤中这些关联消失；相反，M2巨噬细胞与TFH细胞在侵袭性淋巴瘤中呈现富集的空间关联。

**使用五例DLBCL全切片图像进行验证**
为评估TMA核心的代表性，研究人员对5例DLBCL全切片图像（共660万细胞）进行分析。通过高斯模糊减除背景校正，成功应用阈值化方法。比较WSI与对应TMA核心的细胞类型丰度，发现总体趋势一致（B细胞、T细胞占主导），但部分样本因包含结缔组织而出现差异。邻域富集分析（排除自关联）显示B细胞与T细胞呈负关联，而髓系-内皮、基质-内皮及T细胞-巨噬细胞对呈正关联，这些模式与TMA结果一致，表明WSI可提供更全面的空间背景。

**讨论与结论**
讨论部分指出，当前工作采用手动阈值化进行细胞类型分配，虽可控制可变性，但自动化方法（如astir）可能对数据质量或批次效应敏感，因此人工介入仍必要。对于多平台研究，建议分别分析后整合空间统计结果。未来，spatialproteomics将随技术发展演进，通过统一编程接口整合外部工具。通过其与spatialdata格式的互操作性，spatialproteomics支持在统一数据结构中联合分析空间蛋白质组学和空间转录组学数据，从而为多模态研究开辟新途径。