《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Krüppel-like factor 4 downregulation during esophageal cancer formation facilitates immune evasion and impairs immunotherapy
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受损的抗原加工和呈递是癌症免疫逃逸的关键，但其潜在机制尚未完全明确。在此，研究人员表明，在癌症发展过程中，Krüppel样因子4（KLF4）表达的下调在这一免疫决定性过程中至关重要。研究人员发现，受抑制的KLF4表达导致食管癌中主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHC
受损的抗原加工和呈递是癌症免疫逃逸的关键，但其潜在机制尚未完全明确。在此，研究人员表明，在癌症发展过程中，Krüppel样因子4（KLF4）表达的下调在这一免疫决定性过程中至关重要。研究人员发现，受抑制的KLF4表达导致食管癌中主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHC class I）产生减少，形成限制CD8?T细胞浸润的免疫抑制微环境。机制上，KLF4缺失降低了MHC class I基因座的染色质可及性和增强体（enhanceosome）复合物的形成，从而抑制MHC class I表达。在小鼠同种异体移植模型中，KLF4缺失促进了肿瘤进展和免疫治疗耐药性。研究范围超越食管癌，研究人员揭示，在多种人类癌症类型中，低KLF4水平与高免疫治疗失败率显著相关。研究人员证明，在小鼠模型中，药理学诱导KLF4可增强抗原呈递，增加CD8?T细胞的活性，并提高PD-1阻断疗法的治疗效果。这些发现扩展了研究人员对癌症免疫学的认知，并为改善癌症免疫治疗提供了新的见解。
**论文解读：KLF4作为食管癌免疫逃逸与免疫治疗耐药性的关键调节因子**
**研究背景与科学问题**
食管鳞状细胞癌（ESCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，尽管免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1轴抑制剂）已被纳入晚期或不可切除ESCC的一线治疗方案，但高达60%-70%的患者仍表现出原发性或获得性耐药。这一临床异质性凸显了揭示ESCC免疫逃逸和耐药机制以改善治疗结局的迫切性。抗原通过主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHC class I）进行呈递是抗肿瘤免疫的核心，能使细胞毒性CD8?T细胞识别并清除肿瘤细胞。然而，恶性细胞常通过下调MHC class I表达来逃避免疫监视，这被认为是驱动肿瘤进展和免疫治疗耐药的关键过程。超过半数的ESCC病例表现出MHC class I表达水平降低，提示这一机制可能直接影响免疫检查点阻断疗法的疗效。因此，阐明ESCC中MHC class I抑制的分子机制，并利用药物手段恢复其表达，对于改善该癌症的抗肿瘤免疫和免疫治疗结局至关重要。
Krüppel样因子4（KLF4）是一种锌指转录因子，广泛已知的Yamanaka重编程因子之一，在细胞可塑性、上皮稳态、分化和凋亡中发挥调节作用。KLF4越来越被认为是多种癌症类型的肿瘤抑制因子，包括食管癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌。研究人员先前报道，在ESCC细胞中，KLF4缺失会破坏ANXA1-FPR2信号传导，进而触发成纤维细胞活化以促进肿瘤进展。然而，KLF4是否直接调控肿瘤-免疫相互作用，特别是通过抗原呈递，尚不清楚。
**研究内容与结论**
本研究通过整合人类和小鼠ESCC的单细胞转录组学、空间转录组学和蛋白质组学，揭示了KLF4一个先前未被认识的免疫调节功能。研究结果表明，基底上皮细胞中KLF4的表达维持了MHC class I基因的表达，并促进了与CD8?T细胞的有效互作。KLF4表达的缺失损害了抗原呈递，驱动了免疫抑制性细胞群体的扩增，并减弱了细胞毒性T细胞反应。机制上，研究人员发现KLF4通过招募CREB/ATF1来维持染色质可及性并协调增强体（enhanceosome）复合物的组装，从而激活MHC class I基因转录。此外，通过APTO-253诱导KLF4表达可恢复抗原呈递，并使多种癌症类型的肿瘤细胞对免疫检查点阻断更为敏感。总之，研究人员将KLF4确定为一种上皮细胞内在的抗原呈递主调节因子，并作为克服免疫逃逸和免疫治疗耐药性的候选靶点。此外，泛癌分析的结果表明，这一调控轴可能扩展到其他恶性肿瘤。该论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
**主要关键技术方法**
1. **多组学分析**：研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学（spatial transcriptomics）以及蛋白质组学（proteomics）数据，对人类和小鼠ESCC样本进行多阶段分析，以评估KLF4表达与免疫微环境的关系。
2. **基因编辑与功能验证**：通过CRISPR/Cas9技术敲除（KO）或慢病毒载体过表达（OE）KLF4/Klf4，结合OVA模型抗原系统和OT-I CD8?T细胞共培养杀伤实验，在体外和体内（小鼠同种异体移植模型）验证KLF4对MHC class I表达和CD8?T细胞抗肿瘤功能的影响。
3. **分子机制解析**：利用免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光（IF）等技术，结合公开的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）数据，研究KLF4与CREB/ATF1的相互作用及其对MHC class I基因座染色质可及性和增强体复合物形成的调控。
4. **药理学干预与临床样本分析**：使用KLF4小分子诱导剂APTO-253（已在I期临床试验中验证安全性）处理多种癌细胞，并在小鼠模型中评估其与抗PD-1（αPD-1）抗体联合治疗的协同效果。同时，分析来自多个癌症类型（ESCC、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、黑色素瘤、头颈鳞癌）的公开scRNA-seq数据集，以评估KLF4表达水平与免疫检查点阻断（ICB）治疗反应的相关性。
5. **临床队列与公共数据库分析**：利用来自60例ESCC患者样本的scRNA-seq数据和癌症基因组图谱（TCGA）的甲基化及转录组数据，分析KLF4下调的遗传和表观遗传机制。
**研究结果**
**KLF4在食管癌免疫监视中至关重要**
通过分析多阶段小鼠和人类ESCC样本的单细胞RNA测序数据，研究人员发现上皮细胞内在的抗原加工和呈递活性从癌前病变到浸润性癌逐渐下降。蛋白质组学分析显示，与基底上皮细胞相比，浸润性上皮细胞中抗原呈递通路组分显著降低。通过整合分析，研究人员鉴定出KLF4是变化最显著的调节因子。KLF4 RNA水平与经典MHC class I分子（HLA-A、HLA-B、HLA-C）的RNA水平呈强正相关。在60例ESCC样本的验证数据集中，KLF4低表达的ESCC显示出更低的抗原加工/呈递和MHC蛋白复合物通路评分，以及更少的效应T细胞（Teff）和更多的耗竭T细胞（Tex）、调节性T细胞（Treg）和SPP1?巨噬细胞。空间转录组学分析进一步证实，低KLF4区域含有显著更少的Teff细胞和更多的Tex、Treg及SPP1?巨噬细胞。多重免疫荧光分析也验证了在ESCC进展过程中，KLF4、MHC class I蛋白和浸润性GZMB?CD8?T细胞逐渐且显著下降。
**KLF4缺失降低MHC class I表达以促进ESCC免疫逃逸**
在人类和小鼠ESCC细胞中，KLF4/Klf4敲除（KO）显著降低MHC class I表面表达水平，而过表达（OE）则相反。在小鼠同种异体移植肿瘤模型中，来源于Klf4-KO细胞的肿瘤生长显著加快，并伴有MHC class I蛋白和CD8?、GZMB?CD8?T细胞浸润减少。通过OVA模型系统，研究人员发现Klf4-KO的OVA?肿瘤细胞与OT-I CD8?T细胞共培养后，细胞死亡减少，且OT-I T细胞产生的IFN-γ、GZMB和TNF-α水平降低。在体内，当使用抗CD8β抗体耗尽CD8?T细胞后，Klf4-KO和对照肿瘤的生长速度差异消失，表明Klf4缺失对肿瘤生长的促进作用依赖于CD8?T细胞。此外，在肺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌和黑色素瘤等多种癌细胞系中，KLF4的敲低或过表达也一致地调节MHC class I表达，并影响CD8?T细胞介导的杀伤。
**KLF4在增强体复合物形成和MHC class I转录激活中至关重要**
机制研究表明，KLF4/Klf4的KO或敲低（KD）在转录水平上显著降低MHC class I表达。分析公开的ChIP-seq和ATAC-seq数据发现，KLF4不直接结合HLA-A/B/C启动子区域，但其过表达增强了这些基因座的染色质可及性，而KD则相反。这些染色质区域包含对MHC class I转录至关重要的增强子A（enhancer A）和增强体（enhanceosome）复合物。研究人员发现，KLF4可与CREB和ATF1蛋白发生物理相互作用，并在细胞核内共定位。更重要的是，在KLF4过表达的细胞中敲低CREB1或ATF1，会显著降低MHC class I的总蛋白和表面表达水平。
**药理学诱导KLF4增强抗原呈递和抗癌免疫**
APTO-253（一种KLF4小分子诱导剂）处理多种人类和小鼠癌细胞系后，能显著上调KLF4和MHC class I的mRNA及蛋白水平，并增强表面MHC class I表达。在共培养实验中，APTO-253处理的OVA?肿瘤细胞被OT-I CD8?T细胞更有效地杀伤，并诱导更高比例的IFN-γ?、GZMB?和TNF-α?CD8?T细胞。在小鼠同种异体移植模型中，APTO-253治疗显著抑制了肿瘤生长，并观察到肿瘤内MHC class I表达上调以及CD8?T细胞和GZMB?细胞毒性CD8?T细胞浸润增加。
**KLF4是免疫检查点阻断治疗的预测性生物标志物和靶点**
在小鼠模型中将APTO-253与抗PD-1抗体（αPD-1）联合使用，显示出比单独用药更优越的抗肿瘤活性，并伴有更强的CD8?T细胞浸润和活化的CD8?T细胞比例增加。通过分析多个公开的免疫治疗临床队列，研究人员发现，在ESCC、肝癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、黑色素瘤和头颈鳞癌中，对免疫治疗有反应的患者肿瘤细胞中KLF4 RNA表达水平显著高于无反应者。此外，基于KLF4/MHC class I基因特征的预测模型性能优于仅基于PD-L1的模型。
**KLF4下调由启动子高甲基化和拷贝数丢失引起**
全基因组测序分析表明，在ESCC进展过程中，TP53双等位基因缺失是导致KLF4拷贝数减少的原因之一。同时，在高级别上皮内瘤变（HGIN）和ESCC样本中，KLF4启动子区域DNA甲基化水平显著升高。TCGA分析进一步显示，在多种消化系统癌症中，KLF4启动子甲基化水平与RNA表达水平呈强负相关。去甲基化酶抑制剂Bobcat339处理癌细胞系后，KLF4的RNA和蛋白表达水平呈时间依赖性下降。
**总结与讨论**
本研究将KLF4鉴定为ESCC中上皮-免疫相互作用的重要调节因子，其缺失不仅促进肿瘤细胞自身的恶性表型，还削弱了抗肿瘤免疫，导致免疫逃逸和对ICB疗法的耐药。研究揭示了一种新的转录调控机制，即KLF4通过维持染色质可及性和招募CREB/ATF1形成增强体复合物来激活MHC class I转录。研究结论部分总结为：“总之，本研究将KLF4鉴定为ESCC中上皮-免疫相互作用的重要调节因子，并提供了证据表明这一调控机制可能也存在于其他癌症类型。癌细胞中KLF4功能的丧失不仅促进了其自身的恶性表型，还削弱了抗肿瘤免疫，导致癌细胞免疫逃逸和对ICB治疗的耐药。这些发现拓宽并加深了我们对癌症免疫逃逸机制的理解，并为通过药理学手段恢复KLF4活性以改善抗肿瘤免疫治疗提供了新的见解。”
