《Advanced Engineering Materials》：Light-Assisted 3D Printing Techniques and Photocrosslinking Strategies: Recent Advances in Musculoskeletal Tissue Engineering
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肌肉骨骼（MSK）疾病是影响超过17亿人的重大全球健康挑战，导致身体残疾以及心理健康和社会经济福祉下降。尽管其患病率很高，但与其他全球健康优先事项相比，MSK疾病的研究资金仍然严重不足。组织工程与再生医学（TERM）可利用基于光的三维生物打印和光交联方法来治疗
肌肉骨骼（MSK）疾病是影响超过17亿人的重大全球健康挑战，导致身体残疾以及心理健康和社会经济福祉下降。尽管其患病率很高，但与其他全球健康优先事项相比，MSK疾病的研究资金仍然严重不足。组织工程与再生医学（TERM）可利用基于光的三维生物打印和光交联方法来治疗和研究MSK疾病。基于光的生物打印技术，如数字光处理和立体光刻，能够创建高分辨率支架，模拟MSK组织复杂且高度有序的结构；而光交联方法可更广泛地应用于非光基技术，以改善墨水或支架的稳定性。这些技术具有推进MSK疗法的潜力；然而，仍需解决对专用光固化材料的需求、细胞毒性问题以及打印构建体的机械性能限制。本系统综述讨论了光辅助三维打印在MSK应用中当前的空白和趋势，研究了过去5年中最常用的生物材料和细胞类型，并强调了推进TERM用于MSK修复和再生的未来研究方向。
论文主体部分总结：
**2 基于光的三维生物打印技术**
**2.1 立体光刻（Stereolithography, SLA）**
立体光刻（SLA）利用紫外（UV）激光以逐层方式将液态树脂光聚合到构建平台上，直至形成最终的三维物体。该过程通过受控的UV光基于计算机辅助设计（CAD）输入实现精细结构。SLA有自上而下或自下而上两种设置，后者更为经济，所需树脂体积更小。SLA也指用于表示三维模型的.stl文件格式。SLA的优势在于创建复杂结构，例如打印模拟人体组织细胞结构的精细特征，适用于组织支架制造。
**2.2 数字光处理（Digital Light Processing, DLP）**
数字光处理（DLP）是SLA的一种类型，利用光固化光固化树脂槽中的预定图案。与SLA不同，DLP通过投影UV光一次性固化整个材料层，这得益于数字微镜器件（DMD）芯片，该芯片使用反射式微米级镜片将光导向图像中的单个像素（通常由CAD软件生成）。像素大小决定打印机分辨率，可小至1 μm。DLP可快速构建结构，但需优化光强度、层高和固化时间等参数，且树脂选择对参数确定起重要作用。
**2.3 双光子聚合（Two-Photon Polymerization, TPP）**
双光子聚合（TPP）是目前分辨率最高的光聚合技术，可达约100 nm。激光功率、曝光时间和光引发剂选择决定分辨率。TPP利用超快激光根据三维模型图案化光固化树脂。最常用的是负性树脂，其在吸收两个或更多光子时聚合；正性树脂则降解图案化材料以便后续溶解。TPP能产生复杂结构，但受限于打印速度慢，且仅适用于水溶性且含有多光子吸收兼容引发剂的材料。
**2.4 其他基于光的三维生物打印和光交联技术**
除了上述常见技术，还有其他光交联方法。挤出式打印并非基于光的三维打印策略，但常与光交联结合使用：通过挤出墨水丝形成连接的分层结构，并用外部光固化单元在打印过程中或打印后聚合生物墨水以固化支架几何形状。该方法需要高粘度、剪切变稀的墨水以保护细胞，但成本相对较低。激光诱导正向转移（LIFT）是一种无接触方法，利用激光脉冲将生物墨水推进到基底上，可实现单细胞沉积。体积增材制造（VAM）采用线性或断层扫描方法，利用多方向光投影进行快速高分辨率（25-80 μm）三维打印。这些光基技术为TERM应用提供了多种途径，各有优缺点。
**3 生物材料**
**3.1 生物相容性聚合物**
聚合物树脂的选择决定生物相容性支架的性能，包括支持细胞生长和组织形成。天然聚合物如丝素蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原蛋白、透明质酸及其混合配方因出色的生物相容性而常用，但多数需经硫醇化或甲基丙烯酰化等修饰以实现高分辨率光固化。这些聚合物缺乏相对于天然MSK组织的机械强度。例如，明胶是变性胶原蛋白，失去了三股螺旋骨架，力学性能降低。甲基丙烯酰化明胶（gelMA）因甲基丙烯酸酯基团能进行自由基链反应而成为光聚合的常用墨水。可通过改变前体浓度、固化温度等调整水凝胶刚度。复合水凝胶系统如脱细胞外基质（dECM）可增强生物相容性、力学性能和功能性。其他聚合物如透明质酸、胶原蛋白等用于改善细胞粘附或流变性能。
**3.2 光引发剂**
光引发剂在光辅助三维生物打印中至关重要，它们通过受控光照射激发，产生自由基或离子物种引发链聚合。Irgacure 2959（I2959）是UV基打印中广泛使用的光引发剂，在365 nm波长效率最高，但短波长光可能降低细胞活力。这促使了对可见光基3D打印的兴趣，常用光引发剂包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂（LAP）、钌/过硫酸钠（Ru/SPS）和2,4,6-三甲基苯甲酰基二苯基氧化膦（TPO），它们具有低细胞毒性和高打印效率。光引发剂浓度影响支架的可打印性、细胞毒性和力学性能。平衡光聚合效率和生物相容性至关重要。
**3.3 添加剂**
吸收剂可控制光聚合过程，减少穿透深度，防止过度固化，常见UV吸收剂包括酚红、酒石黄和苯并酮-9（R1800），但具有剂量依赖性细胞毒性。填料（如金属、陶瓷或复合颗粒）可增强生物、机械、热或电学性能，常见填料包括羟基磷灰石颗粒（HAp）和β-磷酸三钙（β-TCP），主要用于骨组织工程。其他添加剂如稀释剂、稳定剂和分散剂可调节墨水粘度、均匀性，防止颗粒聚集和沉降。
**4 在肌肉骨骼组织中的应用**
**4.1 骨骼肌**
骨骼肌是体内最丰富的组织，负责机械支持、平衡、运动控制等。体积性肌肉损失（VML）是常见损伤，缺乏常规治疗选项。利用光辅助生物打印的研究较少，但一些研究采用光交联方法。例如，Frías-Sánchez等使用混沌2D打印技术，通过UV光固化受控表面流中的生物墨水，形成均匀的gelMA纤维，维持成肌细胞活力28天。Seyedmahmoud等将gelMA与8%海藻酸盐结合，双交联后促进细胞生长和肌管形成。Ronzoni等评估了商业生物墨水，其中CELLINK FIBRIN在分化方面表现最佳。Urciuolo等利用体内双光子环加成和交联方法，在小鼠皮肤、骨骼肌和脑组织中交叉link生物墨水，支持原位肌肉发育。
**4.2 骨**
骨是骨骼系统的主要结构成分，具有矿化细胞外基质，赋予强度、刚度和弹性。骨损伤和疾病常见，如骨折、骨质疏松、骨关节炎等。骨具有出色的自我再生能力，但临界尺寸缺陷需外部干预。光辅助3D打印在骨组织工程中受到广泛关注。Rajput等利用DLP打印丝素蛋白甲基丙烯酸酯（SILMA）水凝胶，支持细胞增殖。Tao等使用DLP处理骨髓干细胞（BMSCs）与gelMA/葡聚糖乳液，促进成骨分化。Gao等研究gelMA和聚甲基丙烯酸（PMAA）水凝胶，PMAA改善铁螯合特性，促进软骨内成骨。Ren等开发基于gelMA、海藻酸盐和HAp的生物墨水，体内骨修复效果显著。Liang等使用HAp和不同孔形状的DLP打印支架，立方孔支架细胞代谢最活跃。Kumari等使用甲基丙烯酸-κ-卡拉胶（MA-κ-CA）和生物活性二氧化硅纳米颗粒（BSNPs）的复合支架，表现出生物相容性。断层扫描体积生物打印（VAM）也用于快速固化细胞负载水凝胶，Gehlen等利用gelMA基生物树脂实现异细胞共培养，加速成骨分化。
**4.3 软骨**
关节软骨（AC）主要位于关节腔，减少摩擦和缓冲。软骨由浅层、中层和深层组成，各层细胞和ECM成分不同。gelMA是常用前体，常被称为“通用墨水”。Bedell等比较了双功能化与单功能化gelMA，双功能化材料表现出更高细胞活力和钙沉积。Lim等通过结合甲基丙烯酸酯和酪胺制备gelMA-Tyr支架，粘附强度提高15倍。Chu等对海藻酸盐进行双功能化，实现离子和共价双交联，提高强度而不影响细胞活力。Zhu等开发降解的岩藻聚糖-甲基丙烯酸缩水甘油酯水凝胶，力学性能和软骨修复效果优于gelMA。多材料系统如添加甲基丙烯酰化柚皮苷、透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）、葡聚糖、丝素蛋白等可增强支架性能。Shopperly等通过改变HAMA与gelMA比例复制软骨分区特性。Xie等结合软骨来源的dECM和gelMA，促进新软骨形成。合成/混合材料如聚丙烯酰胺（PAM）和聚己内酯（PCL）与SILMA复合，可调节刚度并保持软骨形成能力。孔隙率是重要设计参数，多孔水凝胶支架优于块状水凝胶。FLight生物制造技术利用定制高吞吐量方法生成大孔透明质酸基水凝胶，实现微丝对齐，促进软骨组织成熟。
**4.4 肌腱和韧带**
肌腱和韧带是支持身体稳定和运动的结缔组织。韧带连接骨与骨，肌腱传递肌肉力量至骨。常见损伤包括肌腱病和组织撕裂。当前研究较少，Ma等利用DLP打印含人牙囊细胞的gelMA支架作为牙周韧带补片，体内植入12周后显示纤维定向生长和再生。Del Amo等研究生物打印肌腱移植物结合富血小板血浆，激活炎症和血管生成通路。但总体而言，使用光辅助技术的肌腱和韧带组织工程研究非常缺乏，可能由于技术困难和临床需求不同。
**5 讨论与未来展望**
**5.1 理解光辅助3D打印机制对细胞生长和发育的长期影响**
光辅助生物打印过程中，光固化机制可能影响细胞行为，包括细胞毒性、光吸收和化学副产物。高光强度或长时间曝光可提高分辨率但降低细胞活力。需要优化光引发剂和吸收剂，如Ru/SPS在某些水凝胶中效率更高且细胞毒性更低。大多数研究培养周期较短（14-28天），Galarraga等展示了56天培养后ECM形成使压缩模量从5.2 kPa升至42.0 kPa，强调了长期培养的重要性。功能评估如肌肉收缩力、软骨摩擦系数等应纳入未来研究，以更好地预测体内功能。
**5.2 解决工程化3D组织力学性能不足的问题**
水凝胶支架普遍缺乏适当机械强度。通过增加交联密度或形成二级聚合物网络可改善，但很少有支架达到天然组织水平。软骨弹性模量在0.1-6.4 MPa之间，而大部分研究仅达到kPa范围。FLight支架在56天后瞬时模量约1 MPa，但平衡模量仍低于天然软骨。利用各向异性通道、挤出剪切诱导排列或外部刺激可引导细胞和基质定向。多材料方法（如天然-合成复合材料）和梯度支架可再现组织异质性。初始水凝胶刚度也影响成熟度，较软支架可能有利于长期培养。
**5.3 探索组织支架的可扩展性以模拟复杂人体组织**
当前打印组织局限于小动物模型，体积增材制造（VAM）可快速制造较大尺寸构建体，如连续VAM实现约30 mm截面尺寸，断层扫描VAM超60 cm长度。但大型组织需要血管化。墨水制备的变异性是临床转化障碍，需标准化光固化墨水生产。
**5.4 器官芯片应用**
基于光的生物打印技术适用于器官芯片（OOC）系统，DLP和SLA可制造微米级特征，TPP提供亚微米分辨率，VAM快速制造复杂结构。光辅助挤出打印可制造机械梯度或含颗粒墨水，用于肌肉-骨界面模型。总体而言，光辅助方法因高分辨率、成像透明度和微通道集成能力而适合OOC。
**5.5 三维组织支架的商业化与临床转化**
目前尚无涉及人类MSK组织生物打印的临床研究。手持式挤出设备Biopen支持原位再生医学，通过可见光光固化。其他研究探索原位打印如红外TPP交叉link注射墨水。冷冻保存技术如Jeon等开发的MSC负载OMA微凝胶方案，冷冻前后无显著差异。无细胞支架如Osteofab技术（PEKK聚合物，选择性激光烧结）已获FDA 510(k)审批。商业树脂如CELLINK和Advanced Biomatrix提供多种凝胶墨水，促进实用化应用。
**6 结论**
基于光和非光打印方法产生不同性能和制造效率的构建体，各有优缺点。光基方法分辨率高，适用于组织芯片和血管化支架，可快速交联并联合二次交联提高稳定性。未来需解决技术、生物和后勤挑战，以充分发挥临床和工业潜力，原位打印技术如Biopen可能更广泛应用。通过克服挑战，三维生物打印可能变革肌肉骨骼组织工程，提供个性化和高效的修复方案。
