《Cells》：The Transcriptomic and Proteomic Molecular Signatures of Equine Multiple-System Neuropathy (Grass Sickness)
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马牧草病（EGS或马自主神经功能障碍）是一种主要致命的、影响放牧马的多系统神经病，可能由来源于植物或微生物的神经毒性磷脂酶A2（nPLA2）引起。研究人员研究了EGS中神经元组织的基因和蛋白质表达模式，以阐明神经毒性和神经退行性变可能的机制。对8匹EGS马和6
马牧草病（EGS或马自主神经功能障碍）是一种主要致命的、影响放牧马的多系统神经病，可能由来源于植物或微生物的神经毒性磷脂酶A2（nPLA2）引起。研究人员研究了EGS中神经元组织的基因和蛋白质表达模式，以阐明神经毒性和神经退行性变可能的机制。对8匹EGS马和6匹对照马的颅颈神经节（CCG）组织进行了组织学检查，并用于转录组分析。这些转录组数据与先前发表的、来自不同马匹的EGS相关蛋白质组数据集进行了比较。结果使用网络分析工具BioLayout和Ingenuity Pathway Analysis进行可视化。所有患病马的颅颈神经节均表现出典型的EGS病理学特征。它们还显示出与对照马不同的独特基因和蛋白质表达谱。EGS特征包括参与神经功能的基因和蛋白质（包括离子通道和突触功能基因以及编码线粒体蛋白的基因）表达减少，以及指示细胞应激、细胞死亡和炎症的基因和蛋白质表达增加。该特征可能反映了更广泛的神经退行性变。因此，本研究提高了研究人员对可能与神经毒性神经退行性过程相关的分子变化的理解。
**论文解读文章**
**研究背景与目的**
马牧草病（EGS或马自主神经功能障碍）是一种主要致命的马多系统神经病，影响放牧马匹，在英国和北欧地区发病，死亡率达50%-80%。尽管人类无等效疾病，但猫、狗、兔等动物中也有类似疾病。EGS的典型病理是肠神经、副交感神经和节后交感神经元的广泛染色质溶解，以及脑干和脊髓中的运动神经元损伤。临床体征包括吞咽困难、全身性肠梗阻、出汗、流涎、眼睑下垂、心动过速等，分为急性、亚急性和慢性形式，急性和亚急性死亡率近100%，慢性约50%。病因尚未确认，但近期研究发现骨骼肌神经肌肉接头超微结构异常与神经毒性磷脂酶A2（nPLA2）的作用一致，推测来源于植物或肠道微生物。此前研究报道了EGS马颅颈神经节（CCG）的蛋白质组广泛变化，包括蛋白质错误折叠反应通路紊乱，类似于人类神经退行性疾病。然而，基因表达变化尚不清楚。因此，本研究旨在通过全转录组方法评估CCG基因表达，阐明EGS中神经退行性变过程中的基因水平反应，并更新蛋白质组数据与转录组进行比较。该研究有助于理解自然发生的神经退行性疾病的分子变化。论文发表在《Cells》。
**研究方法**
研究人员从8匹急性或亚急性EGS马（中位年龄7岁，范围7个月-20岁）和6匹对照马（中位年龄11.5岁，范围6-35岁）的CCG样本中提取RNA，使用Agilent 4×44K马基因芯片进行转录组分析，通过RMA归一化。同时，对先前已发表的EGS相关蛋白质组数据集（来自6匹EGS马和6匹对照马，合并样本后进行iTRAQ分析）进行重新处理，使用EquCab3.0数据库，获得4125个注释蛋白。主要技术方法包括：基因芯片分析、网络分析工具BioLayout（用于构建共表达网络和马尔可夫聚类）、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）通路分析、DAVID功能注释、基因集富集分析（GSEA）以及主成分分析（PCA）。样本队列来源于爱丁堡大学兽医伦理委员会批准的马匹尸检样本。
**研究结果**
**3.1 EGS马表现出典型的EGS组织病理学**
通过组织学检查，所有8匹EGS马的CCG均显示神经元肿胀、胞质空泡化、广泛染色质溶解（尼氏体丢失）以及核边缘化和/或固缩，偶见神经细胞吞噬现象；对照马无显著病变。这与先前蛋白质组学研究的马匹结果一致。
**3.2 EGS马具有独特的基因表达谱**
基于所有探针的PCA显示，EGS马与对照马在主成分1（PCA#1）中清晰分离，解释了25.7%的方差，表明EGS相关表达特征。样本间网络分析（BioLayout，相关系数阈值R≥0.93）进一步支持分离，且年龄和性别不构成主要分组因素。
**3.3 GSEA显示EGS马神经功能下调、应激反应和炎症标志物上调**
GSEA分析表明，对照马相对于EGS马富集表达与氧化磷酸化、脂肪酸代谢、脂肪生成、肌生成和血管生成相关的基因；EGS马富集表达与应激反应、凋亡和炎症相关的基因。
**3.4 网络聚类分析确认GSEA结果**
使用BioLayout构建探针间网络图（相关系数阈值r=0.90），通过马尔可夫聚类（MCL，膨胀值2.2）得到1056个含≥5个节点的聚类。图1D显示最大上调和下调聚类的平均表达谱。值得注意的是，每匹马均显示独特的转录本子集升高，独立于EGS状态。
**3.5 EGS中神经功能相关基因下调**
下调聚类（如cluster002）包含1579个探针，对应804个注释基因，涉及神经功能相关基因，如钠、钾、钙离子通道和突触传递蛋白。DAVID分析显示显著富集于多巴胺能突触、苯丙胺成瘾、帕金森病、朊病毒病、阿尔茨海默病和亨廷顿病等KEGG通路，以及微管骨架组织相关术语（如微管蛋白）。
**3.6 EGS中应激反应上调**
上调聚类（如cluster009和cluster010）包含1352个探针，对应671个注释基因，涉及应激和细胞死亡相关基因，如CHAC1和DDIT3（编码未折叠蛋白反应蛋白）。DAVID分析显示富集于凋亡、应激反应、内质网未折叠蛋白反应等GO术语，以及内质网蛋白质加工、核糖体生物发生等KEGG通路。
**3.7 EGS中线粒体功能受影响**
许多编码氧化磷酸化复合物（I、II、IV、V）的基因在EGS中下调，如DIABLO（编码促凋亡蛋白，下调2.8倍）和SLC25A12（线粒体内膜天冬氨酸/谷氨酸反向转运蛋白，下调2.7倍）。同时，上调聚类中包括与线粒体功能障碍和应激反应相关的基因，如RAB24（自噬相关）、SUPV3L1（线粒体RNA解旋酶）和HSPA9（线粒体膜热休克蛋白）。
**3.8 EGS中出现炎症标志物**
GSEA和DAVID分析显示炎症相关基因上调，特别是cluster013富含免疫反应、炎症反应、抗菌肽介导的体液免疫、趋化因子信号通路和TNF信号通路。IFIT家族（IFIT1、IFIT1B、IFIT3、IFIT5）均上调，其中IFIT1升高11.1倍。Toll样受体（TLR2、TLR3、TLR4、TLR8）和JAK2（干扰素信号级联成分）也上调。SAA1（血清淀粉样蛋白A1）在部分EGS马中升高。小胶质细胞/巨噬细胞活化标志物如C1QA、C1QB、C1QC、P2RY13、SPI1、MRC1上调，而CLEC7A轻度升高（其中一个EGS样本比对照高10倍）；但其他标志物如P2RY12、TREM2、CTSS不变，TMEM119、APOE下调。结果表明EGS马CCG中存在炎症反应。
**3.9 基因聚类的IPA分析显示EGS对线粒体的影响**
IPA分析将485个上调基因和721个下调基因映射到神经疾病相关通路，确认线粒体功能下调（特别是线粒体内膜复合物I、III、IV、V）和未折叠蛋白反应上调（包括泛素化改变），与先前蛋白质水平报道一致。
**3.10 EGS和对照样本的蛋白质组分析**
重新处理蛋白质组数据后，发现283个注释蛋白在EGS中减少，336个增加。27个基因（如TUBB4A、NDUFB3、NEFH、NEFM）在转录组和蛋白质组中均下调；32个基因（如CYCS、HSPA5、HSPA9）均上调。部分基因-蛋白对方向相反，如多巴胺β-羟化酶蛋白在EGS中升高2倍，但mRNA减少。IPA分析显示神经功能通路（如NCAM信号、Neurexin-neuroligin信号、Agrin相互作用、Reelin信号、内源性大麻素发育神经元通路）下调，炎症反应通路上调，线粒体蛋白降解通路激活。DAVID分析也确认了神经退行性疾病通路（帕金森病、阿尔茨海默病、朊病毒病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病）的富集。转录组与蛋白质组重叠仅4.2%，但通路分析显示显著重叠，如炎症、代谢紊乱、神经功能抑制等。
**讨论与结论**
本研究首次对马CCG进行转录组分析，并与蛋白质组并行。网络聚类分析揭示了共表达基因群，虽存在个体间差异，但仍识别出在所有EGS病例中改变的基因集。下调基因主要涉及神经功能（离子通道、突触、微管）和线粒体功能（氧化磷酸化），与组织学神经元丢失一致。上调基因主要涉及细胞应激（未折叠蛋白反应）、凋亡和炎症。线粒体功能障碍表现为编码氧化磷酸化蛋白的mRNA减少，而参与线粒体损伤修复的蛋白增加，提示观察到的线粒体可能功能缺陷且数量代偿性增加。炎症反应方面，干扰素诱导的IFIT蛋白家族和Toll样受体家族上调，表明小胶质细胞/巨噬细胞活化，但无组织学浸润证据，可能参与清除受损神经元。此外，纤维化相关标志物（如SMPD1上调、SMPD2下调，ESYT1下调、ESYT2上调）提示结缔组织破坏。未注释探针的存在可能揭示与人类神经退行性疾病相关的新蛋白。蛋白质组和转录组通路分析高度一致，均显示炎症、神经退行性变、代谢紊乱和神经功能抑制。局限性包括：样本来自晚期神经退行性马（尽管病程短），可能不反映早期因果变化；样本量小且年龄分布广，但不同个体蛋白质组分析结果相似，支持结论。总体而言，多组学分析揭示了EGS中神经功能丧失、线粒体功能障碍、应激反应和炎症的分子特征，有助于理解神经毒性神经退行性过程。
**研究结论翻译**
总之，患有急性或亚急性EGS的马CCG的转录组和蛋白质组反映了尸检时发现的大量细胞死亡。基因表达模式与神经元丢失、线粒体功能障碍以及一系列应激相关基因的上调一致，推测是受影响的细胞试图恢复稳态。基因表达变化提示了炎症过程，包括可能的小胶质细胞神经退行性表型。EGS马和对照马基因表达显著变异突出了个体间差异，这可能混淆使用合并结果的分析。通过网络聚类分析检查mRNA水平，研究人员能够在这些个体差异存在的情况下识别上调和下调的基因簇。虽然检测到mRNA并不意味着蛋白质也存在，但它是细胞对导致EGS的损伤的遗传反应的标志，因此指示了细胞在这种情况下可能采取的过程，并得到了更有限的蛋白质组数据的支持。
