《Microbiology Spectrum》：Duplex, extraction-free, HiFi-LAMP assay for point-of-care detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
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沙眼衣原体和淋病奈瑟菌是常见的性传播病原体。虽然感染通常无症状，但如果不予治疗，它们可能导致严重的生殖并发症（例如，附睾炎、输卵管炎、盆腔炎(PID)和不育）。研究人员开发了一种双工高保真环介导等温扩增检测方法，用于同时检测沙眼衣原体和淋病奈瑟菌。该检测方法表
沙眼衣原体和淋病奈瑟菌是常见的性传播病原体。虽然感染通常无症状，但如果不予治疗，它们可能导致严重的生殖并发症（例如，附睾炎、输卵管炎、盆腔炎(PID)和不育）。研究人员开发了一种双工高保真环介导等温扩增检测方法，用于同时检测沙眼衣原体和淋病奈瑟菌。该检测方法表现出高灵敏度和特异性，在25 μL反应体系中，沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的检测极限(LODs)分别为358和30个拷贝。通过使用156对配对的尿液和生殖道分泌物样本与商业单工定量PCR(qPCR)检测进行比较，评估了该方法的性能。在所有样本中，该检测具有100%的特异性，在尿液样本中检测淋病奈瑟菌和在生殖道分泌物样本中检测沙眼衣原体均达到了100%的灵敏度，而在生殖道分泌物中检测淋病奈瑟菌和在尿液中检测沙眼衣原体的灵敏度则分别为98.7%和88.5%。研究人员建立了一种直接使用少量简单处理尿液的免提取HiFi-LAMP检测方法，在70个尿液样本中检测淋病奈瑟菌时显示出87.9%的灵敏度和100%的特异性。新的HiFi-LAMP检测方法可在30分钟内检测出所有沙眼衣原体和/或淋病奈瑟菌阳性样本，这意味着整个HiFi-LAMP检测过程（包括样本处理）可在40分钟内完成，明显短于qPCR检测约90分钟的时间。新的HiFi-LAMP检测方法为资源有限环境下的临床检测和/或沙眼衣原体与淋病奈瑟菌的监测提供了一种快速、简单且具有成本效益的即时检测(POCT)工具。无症状的沙眼衣原体和淋病奈瑟菌感染显著增加了隐性传播的风险。在性活跃人群中沙眼衣原体和淋病奈瑟菌存在共同传播。在156名个体中，检测到7名（4.5%）沙眼衣原体和淋病奈瑟菌双重感染阳性，表明迫切需要快速准确的双工即时检测方法以及时检测沙眼衣原体和淋病奈瑟菌。双工HiFi-LAMP检测方法的开发实现了高灵敏度和特异性地同时检测沙眼衣原体和淋病奈瑟菌。该检测与商业qPCR检测具有高诊断一致性，且成本更低、反应时间更短。鉴于各种便携式荧光热循环仪和/或等温荧光仪的可用性，直接使用简单处理尿液的免提取HiFi-LAMP检测方法的开发将降低性活跃人群进行常规筛查的障碍，并促进资源有限环境下沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的临床检测和监测。
沙眼衣原体和淋病奈瑟菌是全球最常见的可治愈性传播感染病原体，通常无明显临床症状，但未经治疗可导致盆腔炎(PID)及不孕不育等严重并发症，且会增加人类对HIV(人类免疫缺陷病毒)的易感性，带来沉重的社会与经济负担。由于超过半数的感染呈无症状状态，隐形传播风险极高，因此美国疾病控制与预防中心(CDC)等机构强烈建议对性活跃人群进行常规筛查。传统的诊断方法如显微镜检查和培养法受限于样本类型且灵敏度低，而作为金标准的定量PCR(qPCR)技术虽然灵敏度高，却严重依赖复杂精密的仪器、专业技术人员且耗时较长（约1.5小时），难以在资源有限地区广泛开展即时检测(POCT)。为提供一种高性价比的筛查手段，研究人员基于此前开发的HiFi-LAMP方法，开发了一种双工及免提取版本的检测技术，用于快速检测沙眼衣原体和淋病奈瑟菌，该研究成果发表在《Microbiology Spectrum》上，为资源匮乏地区的临床诊断与病原体监测提供了极大便利。
在技术方法层面，研究人员主要采用了以下关键技术：首先利用常规LAMP(环介导等温扩增)筛选针对靶基因的高效引物组，并设计了可被高保真DNA聚合酶切割释放荧光信号的HFman探针，以消除非特异性扩增并实现多重检测；在评估环节，使用了商业qPCR(定量PCR)试剂盒作为金标准进行临床性能对比；为简化流程，研究人员开发了免核酸提取技术，通过将尿液与核酸释放缓冲液等比例混合孵育后按特定比例稀释，直接作为模板进行HiFi-LAMP扩增，临床样本队列来源为昆明医科大学第一附属医院收集的156对配对样本。
研究结果部分主要涵盖以下几个方面：
引物和探针的筛选：研究人员通过对比不同引物组的时间阈值，选择了扩增效率最高的CT2和NG2引物组用于沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的检测。为消除常规LAMP存在的非特异性扩增信号并实现多重检测，研究人员针对环引物设计了HFman探针，经过多轮筛选与优化，最终确定了能够实现无非特异性扩增且具有最佳特异性的探针组合。
HiFi-LAMP检测的灵敏度和特异性：实验数据显示，单工HiFi-LAMP检测能够稳定检测出每25 μL反应体系中低至30个拷贝的病原体。通过概率回归分析测得单重检测对于沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的检测极限(LODs)分别为358和30个拷贝。特异性测试表明，在针对14种常见性传播及呼吸道相关病原体的测试中，均未出现扩增信号，且两种靶标病原体间无交叉反应，展现出优异的特异性。
临床样本的检测性能：研究纳入了156对尿液和生殖道分泌物配对样本。以商业qPCR为对照，HiFi-LAMP检测在所有样本中的特异性达到了100%。在灵敏度方面，生殖道分泌物中的沙眼衣原体和尿液中的淋病奈瑟菌达到了100%；而在尿液中的沙眼衣原体和生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌灵敏度则分别为88.5%和98.7%。通过对比qPCR的循环阈值与HiFi-LAMP的时间阈值发现两者呈显著正相关，证实了样本中的细菌载量特征，且新的检测方法最快可在20分钟内完成。此外，双工HiFi-LAMP检测在包含7个共感染样本的86个样本中表现出与单工检测100%的一致性。
免提取HiFi-LAMP检测的开发与临床验证：为实现即时检测，研究人员将尿液经核酸释放缓冲液处理后以1:6比例稀释，此时的扩增抑制最小。在针对70个尿液样本（含66个淋病奈瑟菌阳性）的评估中，该免提取检测方法的特异度为100%，灵敏度为87.9%。虽因样本投入量极少（约0.214 μL原尿）导致时间阈值略高，但除2个样本外，所有阳性样本均能在30分钟内检出。
在讨论部分，研究人员探讨了样本类型对检出率的影响，指出生殖道分泌物中细菌载量高于尿液，检出率稍高。但尿液样本因其无创性和保护隐私的特点，对降低筛查门槛具有重要意义。免提取技术的运用极大缩减了样本处理时间，且尽管免提取检测的灵敏度略低于常规提取方法，但其各项性能指标基本符合世界卫生组织(WHO)对相关即时检测产品的标准。通过进一步的优化，该方法不仅具有成本效益（每次反应成本低于5美元），而且检测结果快速（总时长不超过40分钟），完全有望满足WHO提出的“REASSURED”即时检测准则要求。
研究结论：研究人员成功开发了一种简单、快速、灵敏且特异的双工HiFi-LAMP检测方法，可实现沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的同时检测。针对两种病原体的检测极限分别为每25 μL反应体系358个拷贝和30个拷贝。该方法在配对临床样本中表现出优异的诊断效能。同时，直接使用简单处理原尿的免提取HiFi-LAMP检测方法在临床样本中验证了其对淋病奈瑟菌的良好检测能力。借助各类便携式实时荧光PCR仪器的普及，这种新型检测方法在资源有限地区的大规模筛查与即时检测中展现出极高的应用潜力。
