《Clinical and Translational Medicine》：m6A-modified DRAM1 recognized by YTHDF1 regulates autophagy during dexamethasone-induced osteogenic inhibition
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骨骼健康关键依赖于成骨细胞的精确调控，而糖皮质激素对此有显著影响。尽管DNA损伤调节自噬调节因子1（DRAM1）在自噬中发挥关键作用，但其在糖皮质激素诱导的骨质疏松中的参与尚未被充分探索。在此，研究人员表明，N6-甲基腺苷（m6A）水平的改变有助于地塞米松处理
骨骼健康关键依赖于成骨细胞的精确调控，而糖皮质激素对此有显著影响。尽管DNA损伤调节自噬调节因子1（DRAM1）在自噬中发挥关键作用，但其在糖皮质激素诱导的骨质疏松中的参与尚未被充分探索。在此，研究人员表明，N6-甲基腺苷（m6A）水平的改变有助于地塞米松处理下DRAM1的调控。在体外，研究人员的研究揭示，高剂量地塞米松损害了YTH m6A RNA结合蛋白F1（YTHDF1）对DRAM1的m6A依赖性调控，导致DRAM1水平降低，进而破坏人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和MC3T3-E1细胞中自噬相关的成骨分化。此外，在骨形成中起关键作用的经典Wnt/β-catenin通路，被证明在成骨分化过程中受DRAM1调控。体内实验显示，Ythdf1敲除（KO）小鼠股骨中DRAM1蛋白表达显著低于野生型（WT）组，且白藜芦醇不仅减轻了地塞米松诱导的骨损伤，还与DRAM1表达增加相关。这些发现增进了研究人员对糖皮质激素阻碍骨形成的理解，并提示靶向m6A依赖的YTHDF1/DRAM1调控轴可能为骨质疏松治疗提供新策略。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
糖皮质激素（GCs）是临床广泛使用的抗炎和免疫抑制药物，但长期或高剂量使用会通过降低成骨细胞和骨髓间充质干细胞（BMSCs）的活性、增殖和分化能力，最终导致骨质疏松。糖皮质激素诱导的骨质疏松（GIOP）是继发性骨质疏松的常见形式，其特征为骨量减少、骨质量下降和骨折风险增加。这些病理变化与自噬减少密切相关：过量的GCs抑制成骨细胞自噬，表现为LC3、Beclin1和ATG等标志物水平降低；而激活自噬的化合物（如维生素K2、京尼平苷、白藜芦醇）能缓解GIOP。因此，增强自噬可能是GIOP的潜在防治策略。
N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化是转录后水平调控基因表达的表观转录组修饰，由甲基转移酶（writers）、去甲基酶（erasers）和结合蛋白（readers）动态调控。YTHDF1作为关键的细胞质m6A阅读器，通过与起始因子和核糖体相互作用促进翻译。研究人员先前发现YTHDF1通过其下游靶点Zfp839增强Runx2转录活性，参与人/小鼠BMSCs的成骨分化。RIP-seq提示DRAM1是YTHDF1的潜在靶点，但二者确切关系及YTHDF1在GC诱导成骨抑制中的作用尚不明确。
DRAM1是一种高度保守的蛋白，主要定位于溶酶体、早期/晚期内体和高尔基体，参与自噬体形成相关复合物（如ULK1、ATG13）的调控，并促进自噬体与溶酶体融合。既往研究报道去卵巢（OVX）大鼠成骨细胞中DRAM1水平升高，促进自噬和凋亡；但长期高剂量GCs对DRAM1表达的影响及其在GC诱导成骨抑制中的作用尚未阐明。
本研究首次阐明YTHDF1在GC暴露下调控BMSCs中DRAM1依赖性自噬的作用，揭示了一个先前未被识别的m6A依赖性YTHDF1/DRAM1调控轴，该轴调节自噬并介导GC诱导的成骨抑制。该发现不仅扩展了对骨代谢表观转录组机制的理解，还为GIOP治疗提供了有前景的分子靶点。论文发表在《Clinical and Translational Medicine》。
**关键技术方法**
研究人员从8名健康男性供体（20–30岁，平均26.5岁）股骨骨折髓内钉固定术中分离人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），并使用MC3T3-E1细胞系（ATCC，传代<20次）。关键技术包括：MeRIP-qPCR（甲基化RNA免疫沉淀-定量PCR）评估m6A修饰水平；RIP-seq（RNA免疫沉淀测序）分析YTHDF1与DRAM1 mRNA结合；荧光素酶报告基因实验验证m6A位点功能；RNA pull-down检测YTHDF1与野生型/突变型DRAM1 RNA结合；核糖体新生链复合物-mRNA分离（RNC-qPCR）评估翻译效率；慢病毒过表达/siRNA敲低/质粒转染调控基因表达；CRISPR-Cas9敲除Ythdf1小鼠模型；微计算机断层扫描（micro-CT）评估骨微结构；钙黄绿素双标记、von Kossa染色、HE染色、免疫组化和免疫荧光分析组织学变化；透射电镜（TEM）观察自噬结构；共聚焦显微镜观察GFP-LC3和GFP-TurboRFP-LC3荧光。
**研究结果**
**3.1 高剂量地塞米松刺激下调hBMSCs和MC3T3-E1细胞中YTHDF1和DRAM1表达**
通过CCK-8实验发现10
-5 M地塞米松显著降低细胞活力；流式细胞术显示G0/G1期阻滞。ALP和ARS染色表明高剂量地塞米松抑制成骨能力，Western blot证实YTHDF1和DRAM1蛋白表达下调。RU486（地塞米松拮抗剂）逆转了成骨抑制，并上调YTHDF1、DRAM1和成骨标志物OCN。免疫荧光进一步确认了高剂量地塞米松降低YTHDF1和DRAM1表达。
**3.2 YTHDF1结合m6A修饰的DRAM1 mRNA并促进其翻译**
MeRIP-qPCR显示地塞米松处理降低hBMSCs中DRAM1的m6A富集。RIP-seq和RIP-qPCR证实YTHDF1与DRAM1 mRNA结合，敲低YTHDF1后结合减少。Ythdf1 KO小鼠股骨中DRAM1蛋白降低但mRNA无变化；MC3T3-E1细胞过表达Ythdf1上调DRAM1蛋白但mRNA无变化。SRAMP预测DRAM1 3′UTR存在6个高置信度m6A位点。荧光素酶报告实验显示Ythdf1过表达增强野生型DRAM1-3′UTR的活性，而对突变型无影响。RNA pull-down证明YTHDF1与野生型DRAM1探针结合更强。RNC-qPCR表明Ythdf1过表达提高DRAM1 mRNA翻译效率。
**3.3 YTHDF1通过DRAM1影响地塞米松暴露MC3T3-E1细胞的成骨潜能**
Ythdf1过表达增加DRAM1、RUNX2和OCN蛋白水平，ALP/ARS染色增强成骨能力。si-Ythdf1敲低则降低DRAM1和成骨标志物，抑制成骨。共转染si-Dram1逆转Ythdf1过表达对RUNX2和BMP2的促进作用，并降低成骨能力。
**3.4 DRAM1通过AKT/rpS6通路及相关信号分子调节自噬活性**
si-Dram1减少GFP-LC3斑点，降低LC3-I向LC3-II转化，增加p62水平；TEM显示自噬结构减少。DRAM1过表达降低p-AKT和p-S6水平。AKT激活剂SC79增加p-S6并降低LC3-II/I比值，AKT抑制剂MK-2206则相反。p70 S6激酶抑制剂PF-4708671增加LC3-II/I比值。
**3.5 DRAM1通过调节自噬流控制成骨分化**
地塞米松抑制自噬流，Baf-A1增加自噬体积累但效果弱于对照组。si-Dram1细胞在雷帕霉素清除后LC3-II持续升高，表明自噬流受损。GFP-TurboRFP-LC3双荧光显示si-Dram1细胞自噬体清除延迟。ARS染色显示si-Dram1组矿化能力降低。
**3.6 DRAM1通过Wnt/β-catenin信号通路调控成骨分化**
si-Dram1降低RUNX2、BMP2、β-catenin和活性β-catenin蛋白水平，免疫荧光显示核内活性β-catenin减少，LiCl（Wnt激活剂）部分恢复矿化。DRAM1过表达则上调这些蛋白，活性β-catenin核定位增加，DKK1（Wnt拮抗剂）抑制矿化增强。
**3.7 基于地塞米松处理的动物实验**
地塞米松处理小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、B.Ar、Cs.Th降低，Tb.Pf升高；白藜芦醇共处理部分逆转变化。钙黄绿素双标记、HE、VK、COL1A1免疫组化支持micro-CT结果。TRAP染色显示地塞米松抑制破骨细胞活性。免疫组化和免疫荧光显示地塞米松降低DRAM1表达，白藜芦醇则增加DRAM1。
**总结与讨论**
本研究系统揭示了地塞米松通过m6A-YTHDF1-DRAM1轴调控自噬和Wnt/β-catenin通路，从而抑制成骨分化的机制。地塞米松以剂量依赖性方式影响成骨：低剂量增强，高剂量抑制并下调YTHDF1和DRAM1。YTHDF1通过识别DRAM1 mRNA的m6A位点促进其翻译；地塞米松破坏该过程。DRAM1通过AKT/rpS6通路调节自噬，并通过Wnt/β-catenin通路影响成骨。体内实验显示白藜芦醇通过上调DRAM1减轻地塞米松诱导的骨损伤。与既往OVX模型不同，GIOP模型中DRAM1表达降低，提示不同骨质疏松模型存在机制差异。本研究的局限性包括：主要基于小鼠模型和体外细胞系，样本量较小，且未探索其他潜在调控机制。未来需扩大人类病理样本分析，增加样本量，并深入研究YTHDF1和DRAM1在不同模型中的作用，开发靶向疗法的潜力。研究结论：地塞米松通过下调YTHDF1表达和DRAM1 mRNA的m6A修饰，抑制YTHDF1介导的DRAM1翻译，进而削弱自噬和Wnt/β-catenin信号，最终抑制成骨分化。靶向YTHDF1/DRAM1调控轴可能为GIOP治疗提供新策略。
