硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP），一种氧化还原调节因子，介导原发性黑色素瘤的EPAC-RAP1信号依赖性

《Oncogene》：Thioredoxin interacting protein (TXNIP), a redox regulator, mediates the EPAC-RAP1 signaling dependency of primary melanoma

　　

由黑素细胞起源的皮肤原发性黑色素瘤的进展可导致致死性转移性疾病。控制皮肤中原发性黑色素瘤生长并促进其进展的分子机制尚未完全阐明。此前，研究人员已证明RAP鸟嘌呤核苷酸交换因子EPAC1/2（Exchange Proteins Activated by cyclic AMP）促进原发性黑色素瘤的生长，而对EPACs依赖性的丧失与转移性进展相关。在本研究中，研究人员证明，EPACs在黑素细胞恶性转化过程中被激活，而化学抑制或基因敲除EPAC可抑制Braf/Pten小鼠的黑素瘤发生。原发性黑色素瘤中EPAC mRNA及其效应分子RAP1-GTP蛋白的低表达与更好的无复发生存期相关。使用EPAC抑制剂处理配对的原发性和转移性黑色素瘤细胞后进行RNA测序（RNAseq）分析显示，TXNIP（一种氧化还原稳态的重要调节因子）是EPAC信号的下游效应分子。研究人员还证明，EPACs通过激活雷帕霉素复合物1（mTORC1）的机制靶点来调节氧化还原稳态和线粒体活性氧（ROS），从而稳定缺氧诱导因子1-α（HIF-1α），后者是氧化还原调节因子TXNIP和糖酵解酶的转录激活因子，进而促进黑色素瘤生长。研究数据表明，靶向黑色素瘤细胞绕过EPAC依赖性的机制是一种潜在的治疗方法。

**论文解读：硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）介导原发性黑色素瘤的EPAC-RAP1信号依赖性**

**研究背景与问题**

皮肤黑色素瘤起源于黑素细胞，其原发性肿瘤的进展可导致致死性转移性疾病。尽管靶向治疗和免疫检查点阻断取得了进展，但治疗的有限有效性和耐药性仍是主要挑战。氧化应激通过可逆的代谢改变增强黑色素瘤细胞耐受氧化应激的能力，在转移性进展中起关键作用。然而，驱动这些适应性改变的分子机制尚不完全清楚。

环磷酸腺苷激活的交换蛋白（EPAC1/2）是RAP鸟嘌呤核苷酸交换因子，在多种正常细胞和组织中参与氧化还原稳态的调节，并在免疫调节中发挥作用。在癌细胞中，EPACs已知调节细胞增殖、迁移和侵袭。研究人员先前发现，EPAC信号通过刺激mTORC1活性优先调节原发性黑色素瘤细胞的生长，并且对EPAC信号依赖性的丧失与黑色素瘤进展相关。然而，EPACs在体内黑素瘤发生中的作用以及EPACs选择性促进原发性黑色素瘤细胞生长的分子机制仍有待阐明。因此，本研究旨在揭示EPACs在黑素瘤发生中的作用机制，并探索其作为治疗靶点的潜力。

**研究内容与结论**

本研究通过一系列体内外实验，系统阐明了EPAC-RAP1信号在原发性黑色素瘤生长中的关键作用及其分子机制。主要发现包括：EPACs在黑素细胞恶性转化过程中被激活，且其活性对于转化黑素细胞的生长是必需的；在Braf/Pten小鼠模型中，系统性抑制EPACs或条件性敲除黑素细胞中的Epac1/2可延缓黑素瘤发生并抑制肿瘤生长；EPACs通过调节氧化还原稳态和线粒体ROS，以及激活mTORC1-HIF-1α-TXNIP信号轴，促进原发性黑色素瘤生长；低表达EPAC mRNA和RAP1-GTP蛋白与原发性黑色素瘤患者更好的无复发生存期相关。这些发现揭示了EPAC信号在原发性黑色素瘤中的促生长机制，并为靶向治疗提供了新策略。

**重要意义**

该研究不仅阐明了EPAC信号在原发性黑色素瘤中的关键作用，还提出了“靶向EPAC信号用于预防和干预局限性黑色素瘤，而靶向转移性黑色素瘤细胞绕过EPAC信号的机制则是晚期黑色素瘤的新型治疗选择”这一重要概念。论文发表在《Oncogene》上，为黑色素瘤的早期干预和转移性治疗提供了新的理论基础和潜在靶点。

**主要关键技术方法**

1. **RNA测序（RNAseq）分析**：对配对的原发性（WM115）和淋巴结转移性（LN-met）黑色素瘤细胞系（WM266-4、WM239A、WM165-1）进行EPAC抑制剂（ESI-09）处理后的差异基因表达分析，并使用MSIgDB数据库进行通路富集分析。数据来源于UW-Madison基因表达中心，并上传至GEO数据集（GSE319527）。
2. **TCGA数据库分析**：分析皮肤黑色素瘤（TCGA，Firehose Legacy）中479例患者的mRNA表达和临床结局数据，重点关注原发性黑色素瘤患者中RAPGEF3和RAPGEF4 mRNA表达与无病生存期（DFS）的关系。
3. **多重定量免疫组化（IHC）**：使用Opal七色IHC试剂盒对市售和自建的组织芯片（TMA）进行染色，检测RAP1-GTP、Ki67、S100A等标志物，并通过Inform软件进行定量分析。TMA来源包括US Biomax（ME483）和自建TMA。
4. **基因敲除与过表达**：使用siRNA敲低EPAC1/2，以及构建TXNIP过表达慢病毒和降解抗性HIF-1α（p402A/p564A）质粒，进行功能验证。
5. **小鼠模型**：采用免疫健全的Braf/Pten小鼠模型进行4-羟基他莫昔芬（4HT）诱导黑素瘤发生，并构建条件性敲除Epac1/2的小鼠；同时使用免疫缺陷NSG小鼠进行人源肿瘤异种移植模型，评估药物（ESI-09、vemurafenib、selumetinib）疗效。

**研究结果**

**EPAC-RAP1信号与皮肤原发性黑色素瘤的侵袭性相关**
- 通过对TCGA数据及TMA的定量IHC分析，研究人员发现：高表达EPAC1/2 mRNA与原发性黑色素瘤患者更差的无病生存期显著相关；RAP1-GTP蛋白水平与增殖标志物Ki67在原发性病变中呈正相关，但在淋巴结转移中不相关；高RAP1-GTP表达与更高的转移复发风险相关。

**PI3K-AKT信号上调黑素细胞中EPAC1/2的表达，且EPAC2活性对转化黑素细胞的生长是必需的**
- 在体外培养的新生人类黑素细胞（NHM）中，表达BRAF^V600E和敲低PTEN可显著上调EPAC1/2 mRNA和蛋白水平，且伴随RAP1-GTP活性增加。使用PI3K或AKT抑制剂可消除这种上调。EPAC2选择性抑制剂或siRNA敲低EPAC2可抑制转化黑素细胞的生长，并增加衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞比例，表明EPAC2在抑制癌基因诱导的衰老中起关键作用。

**系统性抑制EPAC1/2活性可延缓体内黑色素瘤生长**
- 在Braf/Pten小鼠模型中，腹腔注射EPAC抑制剂ESI-09可显著延缓肿瘤生长，提高小鼠生存期（中位生存期111天 vs 对照组83天，HR=0.3829）。

**基因敲除Epac1/2可减少黑色素瘤生长**
- 条件性敲除Epac1/2（双杂合或双纯合）小鼠的肿瘤发生率显著降低，肿瘤潜伏期延长，总生存期显著改善。双杂合小鼠中位生存期95天，双纯合小鼠123天，优于对照组的56天。此外，免疫荧光染色显示，Epac1/2敲除肿瘤中CD8⁺ T细胞频率增加，提示EPACs可能通过抑制免疫反应促进肿瘤生长。在免疫缺陷NSG小鼠中，EPAC抑制剂对肿瘤生长无明显抑制作用，进一步支持免疫机制参与EPAC依赖的生长促进。

**EPAC抑制引起的基因表达变化**
- RNAseq分析显示，在原发性WM115细胞中，ESI-09处理6小时即显著下调TXNIP和ARRDC4基因；12小时后，大量基因表达改变，富集于E2F靶点、G2/M检查点、糖酵解和TGF-β信号通路。而在转移性细胞中，仅TXNIP被下调。qRT-PCR和免疫印迹验证了TXNIP在原发性黑色素瘤细胞中高表达，且被EPAC抑制下调。

**TXNIP是EPAC信号的下游效应分子**
- siRNA敲低EPAC1/2或EPAC2可抑制原发性黑色素瘤细胞生长，并伴随TXNIP蛋白表达下降。从Epac1/2敲除小鼠肿瘤中建立的细胞系也显示TXNIP表达降低。过表达TXNIP可部分缓解EPAC抑制剂引起的生长抑制，证明TXNIP是EPAC信号的下游效应分子。

**EPAC-mTORC1-HIF-1α轴调节TXNIP表达**
- EPAC抑制剂处理可快速（6小时内）消除HIF-1α蛋白表达，而使用钴氯化物（CoCl₂）稳定HIF-1α或过表达降解抗性HIF-1α（p402A/p564A）可恢复TXNIP水平并缓解生长抑制。雷帕霉素抑制mTORC1也可降低HIF-1α，提示EPAC通过mTORC1稳定HIF-1α。此外，RNAseq显示，ESI-09处理下调了多种糖酵解酶（如PFKL、ALDOC、PKM、PGK1、ENO1、LDHA）的表达，表明EPAC信号通过HIF-1α调节代谢。

**EPAC信号独立于氧化还原稳态调节TXNIP表达**
- 抗氧化剂MitoQ和罗丹酮可抑制原发性黑色素瘤细胞生长，但两者与ESI-09联合使用产生叠加效应，且MitoQ不影响TXNIP水平。抗氧化剂NAC和GSH可促进原发性细胞生长，但不能逆转ESI-09对TXNIP的抑制，提示EPAC通过TXNIP依赖和独立机制共同调节氧化应激。

**EPAC信号不参与原发性黑色素瘤细胞表型转换**
- 分析表型转换标志物（MITF、E-cadherin、AXL、N-cadherin）以及细胞侵袭和迁移实验表明，EPAC抑制不诱导原发性黑色素瘤细胞向侵袭性表型转换。

**总结讨论**

本研究证明，EPAC-RAP1信号通过多种机制促进原发性黑色素瘤生长，这些机制汇聚于细胞氧化还原稳态、线粒体ROS产生和糖酵解的调控。研究首次揭示TXNIP是EPAC信号的下游效应分子，并阐明了EPAC-mTORC1-HIF-1α-TXNIP信号轴在其中的核心作用。此外，研究还发现EPAC依赖性的丧失与黑色素瘤转移性进展相关，提示转移性黑色素瘤细胞通过绕过EPAC信号获得生长优势。

**研究结论**

研究人员得出结论：EPAC通过多种机制调节原发性黑色素瘤生长，包括（i）RAP1-GTP介导的线粒体ROS产生调控，（ii）mTORC1介导的蛋白质翻译、细胞代谢和细胞周期进程，以及（iii）mTORC1-HIF-1α介导的TXNIP/TRX（氧化还原稳态关键调节因子）调控。对这些细胞功能的EPAC依赖性的丧失与黑色素瘤转移相关。研究人员提出，识别转移性黑色素瘤中绕过EPAC依赖性的机制，将有助于发现独立于黑色素瘤致癌驱动因素的新型治疗靶点。