《Talanta》：Fluorescence Lifetime Imaging of G-Quadruplex RNA Dynamics in Alzheimer's Disease Using a Novel Nucleic Acid-Sensitive Probe
编辑推荐：
摘要实时监测G四链体（G4）RNA的动态变化对于了解其在阿尔茨海默病的发展和治疗中的生物学作用至关重要。然而，这一任务因两个关键难题而面临挑战。首先，现有的荧光探针在活细胞竞争环境中缺乏足够的选择性，难以区分G4 RNA与G4 DNA以及其他非G4二级结构。其次，基于荧光强度的成
摘要
实时监测G四链体（G4）RNA的动态变化对于了解其在阿尔茨海默病的发展和治疗中的生物学作用至关重要。然而，这一任务因两个关键难题而面临挑战。首先，现有的荧光探针在活细胞竞争环境中缺乏足够的选择性，难以区分G4 RNA与G4 DNA以及其他非G4二级结构。其次，基于荧光强度的成像技术由于荧光团吸收程度和光漂白现象的影响，无法检测到G4 RNA的细微变化。在此，我们报道了一种新型噻唑橙衍生物（TOGR），可用于对活细胞中的G4 RNA进行荧光寿命成像。通过对噻唑橙的结构改造，提升了其与RNA的结合亲和力及对G4的结构选择性。TOGR在与G4结构结合时表现出独特的荧光寿命，这使得可通过FLIM技术无需考虑探针浓度即可灵敏检测G4的形成情况。FLIM成像结果显示，TOGR主要定位于细胞质和核仁中的RNA上。由于其在竞争性细胞环境中的优先RNA结合亲和力，TOGR能够选择性地监测G4 RNA的动态变化，从而有助于在不受G4 DNA干扰的情况下探究G4 RNA在细胞中的新功能。重要的是，利用这种具有寿命敏感性和RNA选择性的成像探针，我们成功揭示了阿尔茨海默病病理过程中G4 RNA的动态行为，以及糖皮质激素对G4 RNA动态的影响。这项研究不仅为设计更先进的探针以实现对G4 RNA的详细成像奠定了基础，也为探索阿尔茨海默病中与G4 RNA相关的病理机制提供了依据。
引言
G四链体RNA（G4 RNA）是一种非典型的核酸二级结构，它通过鸟嘌呤富集序列中的Hoogsteen型氢键形成[1]、[2]。这种独特的结构会阻碍蛋白质或其他核酸与RNA序列的结合，从而像分子“开关”一样调控RNA的功能[3]、[4]。作为重要的转录后调控元素，G4 RNA通过调节APP和Tau等关键致病蛋白的表达，对阿尔茨海默病（AD）的病理进展起着重要作用[5]、[6]。G4 RNA与AD之间的关联代表着一个新兴的研究领域。研究G4 RNA有望为AD的治疗提供新的策略，这类策略旨在改变疾病进展进程而非仅仅缓解症状[7]。通过细胞生物学、遗传学和蛋白质组学等多种方法，人们在揭示G4 RNA的作用机制方面已取得显著进展。例如，借助算法（QGRS Mapper、G4Hunter）[8]、[9]以及电子显微镜[10]等技术，人们已经确认G4结构在神经元中广泛存在，并且在调控神经元关键功能方面发挥着重要作用[11]、[12]。许多与AD核心病理过程相关的mRNA（如APP、BACE1、MAPT等）在其5'或3'非翻译区都含有可能形成G4结构的序列[13]、[14]、[15]。在AD患者的脑组织中，尤其是海马体和皮质区域，检测到了G4 RNA水平的显著升高，且其分布与病理区域重叠[16]、[17]。然而，目前对于AD中G4 RNA的动态行为仍了解不足，这阻碍了对与G4 RNA相关的AD病理机制的深入研究[18]。这一局限主要是由于缺乏简单高效的研究方法和工具。因此，迫切需要一种可靠的方法来实时监测AD病理过程中G4 RNA的动态变化。
荧光成像是研究细胞内各种生物分子动态变化的强大工具。目前已有多种工具被用于可视化G4 RNA，比如BG4抗体[19]、小分子探针ThT[20]、纳米探针BioTASQ[21]以及经过工程改造的GFP系统[22]。但这些方法都存在一定的局限性。例如，BG4抗体仅适用于固定细胞，无法用于监测活细胞中的G4 RNA动态。小分子探针ThT的选择性较差，信噪比也较低；而BioTASQ虽然选择性较高，但需要复杂的合成过程。基因编码的探针分子由于体积较大，可能会干扰G4的自然动态变化，而且还需要进行转染以及复杂的操作流程。此外，这些方法还存在两个共同的问题：在活细胞竞争环境中难以区分G4 RNA与G4 DNA，而且依赖强度的成像方法容易受到探针吸收程度和光漂白现象的影响。荧光寿命成像（FLIM）作为一种新兴的荧光成像技术，为解决这一问题提供了希望，因为荧光探针的激发态寿命取决于其化学环境，而非浓度或荧光强度[23]。由于G4 RNA是RNA折叠形成的二级结构，因此将特异性标记细胞内RNA与荧光寿命成像相结合，是监测活细胞中G4 RNA动态变化的理想方法。
在此，我们开发了一种新型噻唑橙（TO）衍生物探针——TOGR。为了全面概述G4探针技术的进展，并突出我们新开发的TOGR探针的优势，我们在表S1中总结了各类代表性G4探针的关键特性。我们选择具有较强G4选择性的TO作为核心探针，然后通过p-桥引入N,N-二乙苯胺基团，形成了扭曲的分子内电荷转移（TICT）结构。这样的设计使得TOGR在水中不发光，但其荧光寿命却会对环境变化敏感。此外，更高的平面度以及更长的电子共轭链增强了该探针与G4结构的π-堆叠相互作用，进而提升了其对G4的结构选择性。TOGR优先与RNA结合，且在与G4 RNA结合时会产生与其他物质不同的荧光寿命。这些特性使得可以通过FLIM技术精准地观察活细胞中G4 RNA的分布和动态变化，且不会受到G4 DNA的干扰。重要的是，TOGR与FLIM技术的结合能够有效捕捉阿尔茨海默病发展过程中G4 RNA的实时变化，同时还能揭示体内重要调控分子——糖皮质激素对这一过程的影响，从而为了解AD的病理机制及其动态进展提供新的见解。这些发现不仅为进一步研究G4 RNA的动态变化奠定了基础，也为理解与异常G4 RNA行为相关的疾病提供了有力依据。
章节节选
实验部分
有关通用试剂、材料以及部分实验细节的信息详见补充信息。
探针设计
为了解决既能对G4 RNA产生响应，又能对其荧光寿命敏感度高的问题，我们开发了一种新型阳离子型TO-乙烯基-N,N-二乙苯胺衍生物，命名为TOGR（见图1A和图S1）。TOGR的设计包含了多项创新元素，这些元素提升了其在细胞环境中的功能表现：1）结构配置：由于TO已被证明对G4结构具有较高的选择性[26]，因此我们将其作为探针的核心结构，同时通过对它进行结构改造
结论
总之，我们开发出了TOGR，这是一种新型的小分子荧光探针，可通过荧光寿命成像技术来监测G4 RNA的动态变化。TOGR在与G4结构结合时会产生独特的荧光寿命，这使得它能够有效区分G4结构与非G4结构的核酸构象。此外，TOGR主要定位于富含RNA的细胞区域，再加上它在竞争性细胞环境中的优先RNA结合亲和力，使其具备选择性
CRediT作者贡献说明
方宇秦：数据整理。郭硕：写作——审阅与编辑、资金获取、概念构思。韩光梅：写作——审阅与编辑、实验指导。张忠平：实验指导。黄伟：写作——审阅与编辑、资金获取、正式分析、数据整理。王秀：正式分析、数据整理。张璐：数据整理。陶曦：数据整理。王东：写作——初稿撰写、项目管理、方法设计、资金获取、正式分析、数据整理，
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究工作的已知利益冲突或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究工作的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了安庆师范学院的科学研究启动基金（编号：231144）、安徽省先进催化与能源材料重点实验室的开放基金（编号：ZD2025B01）、池州学院的科学研究启动基金（编号：CZ2025YJRC167）以及四川省科学技术厅的相关项目（编号：2024NSFSC1545）的支持。
Dong Wang|Wei Huang|Xiu Wang|Lu Zhang|Xi Tao|Fangyu Qin|Shuo Guo|Guangmei Han|Zhongping Zhang
中国安徽省池州市池州学院材料与环境工程学院，安徽省高等学校微纳粉末与先进能源材料重点实验室，邮编：247000
