综述：mRNA的m5C甲基化：问题仍多于答案

《Cells》：m5C Methylation of mRNA: Still More Questions Than Answers

　　

mRNA在遗传信息传递的细胞过程中扮演关键角色，其核苷酸的转录后修饰能够调控这些过程，每个特定mRNA均如此。m⁵C甲基化是一种特定的RNA修饰，在tRNA、rRNA、lncRNA及其他类型的非编码RNA中相当常见，而在mRNA中则发现得并不频繁。然而，m⁵C甲基化mRNA的功能与非甲基化mRNA存在显著差异。在人类八种m⁵C RNA甲基转移酶中，仅发现NSUN2和NSUN6能够修饰细胞mRNA的主要部分。NSUN2和NSUN6的缺乏会导致转录组（transcriptome）和翻译组（translatome）的全局变化，而人类NSUN2基因的缺陷与神经退行性疾病和智力障碍相关。尽管近年来对m⁵C mRNA甲基化的研究密集，但该现象的许多方面及其意义仍然存在问题且远未阐明。在这篇综述中，研究人员讨论了关于mRNA甲基化组生物发生的现有信息、其研究分析方法、m⁵C修饰对mRNA生命的影响，并将其置于细胞生物学的一般背景下，试图阐明m⁵C mRNA甲基化的生物学相关性。研究人员强调了出现的主要不一致性和困难，分析了其可能原因，并提出了进一步研究的潜在方向，这些方向可能澄清争议问题，并建立NSUN2缺陷与神经退行性疾病之间的联系。

论文主体部分总结如下：

**1. 引言**
近年来，m⁵C mRNA甲基化研究数量显著增加，这无疑归因于mRNA在遗传信息传递细胞通路中的核心作用，进而影响基因表达调控机制。大量证据表明，m⁵C甲基化影响mRNA生命的多个方面，包括核质输出、稳定性、翻译效率、亚细胞定位等。这些过程紧密相连，一个环节的变化会不可避免地影响其他环节，且常难以确定原发原因。尽管已有众多详细综述描述了RNA（包括mRNA）m⁵C甲基化的研究进展，但在讨论m⁵C mRNA甲基化时，仍有许多未知甚至矛盾之处。因此，有必要仔细审视现有知识，以理解该领域的当前状态和未来前景。

**2. 参与mRNA m⁵C甲基化组生物发生的蛋白质**
m⁵C是多种小RNA和非编码RNA中最常见的修饰之一，这些RNA的空间结构和稳定性对其加工或特定功能至关重要。因此，m⁵C甲基化可能在这些RNA的加工和结构稳定中发挥重要作用。该修饰由NOL1/NOP2/SUN结构域家族甲基转移酶以及DNA甲基转移酶同源物TRDMT1执行，它们使用S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体。所有NSUN家族甲基转移酶共享一个含Rossmann折叠催化核心的SAM依赖性MTase RsmB/NOP型结构域。TRDMT1具有执行相同功能的SAM MT C5结构域。此外，NSUN2和NSUN6具有PUA结构域，可能提供额外的RNA结合位点。尽管所有RNA甲基转移酶对不同RNA底物具有特异性，但NSUN2和NSUN6还能额外甲基化mRNA（NSUN5也可能甲基化少量mRNA）。与DNA中胞嘧啶残基甲基化、识别和去除的蛋白质类似，参与RNA中类似过程的蛋白质也被称为“写入器”（writers）、“读取器”（readers）和“擦除器”（erasers）。写入器即甲基转移酶本身；读取器是偏好含m⁵C残基RNA区域的典型RNA结合蛋白；擦除器是逐步氧化并去除胞嘧啶残基甲基的酶。

**3. 鉴定mRNA中m⁵C位点位置**
已提出多种利用高通量测序的策略来确定mRNA中m⁵C修饰的位置。最早的方法是亚硫酸氢盐转化测定（Bis-seq），它基于C残基（与m⁵C不同）能与亚硫酸氢盐反应脱氨形成U残基。在RNA-seq中，不发生C-U转换的位置被视为m⁵C位点。然而，游离mRNA常具有复杂的二级和三级结构，可能屏蔽某些区域，导致假阳性信号。RIP-seq方法基于使用m⁵C特异性抗体对片段化mRNA进行免疫沉淀，随后测序，可检测含m⁵C残基的区域，但无法精确定位，且高度依赖抗体特异性。基于识别NSUN酶结合位点的方法包括Aza-IP-seq和miCLIP-seq，它们利用酶与催化中心胞嘧啶残基的不同交联方式。Aza-IP-seq使用胞苷类似物5-氮杂胞苷，miCLIP-seq使用NSUN2突变体NSUN2(C271A)稳定共价键。这些方法不直接鉴定m⁵C位点，而是指示其潜在位置。此外，还有PAR-CLIP等方法用于直接确定酶与mRNA的接触位点。最近还提出了基于“读取器”和“擦除器”识别的间接方法，如m⁵C-TAC-seq、TAWO-seq和DRAM。所有方法都能检测到数千个m⁵C位点，但不同方法结果的重叠率很低，表明数据需谨慎对待，包括数据库如“m⁵C Atlas”。

**4. mRNA m⁵C写入器**
m⁵C RNA甲基化的主要事件发生在细胞核，许多m⁵C甲基转移酶主要定位于核。然而，部分酶位于其他细胞区室：NSUN3和NSUN4修饰线粒体RNA，NSUN6定位于细胞质，TRDMT1兼具细胞质和核定位，NSUN2除核外还可在线粒体和细胞质囊泡中发现。m⁵C修饰主要由NSUN2和NSUN6引入mRNA。基于它们的亚细胞定位，mRNA的m⁵C甲基化可发生在细胞核甚至共转录过程中，也可发生在细胞质。NSUN5（靶标为核仁28S rRNA）也被发现能修饰mRNA。NSUN7虽在精子发生中重要，但缺乏催化活性。NSUN6与底物复合物的空间结构已解析，表明RNA结构和修饰位点环境对m⁵C甲基化至关重要。NSUN6对tRNA和mRNA底物的识别方式不同，使用不同的RNA结合表面。NSUN2的识别位点信息则较为矛盾，可能缺乏优选的线性延伸区域，而是通过识别特定空间结构结合mRNA。最近冷冻电镜结构显示，NSUN2识别tRNA基于其受体臂、T臂和可变环的结构，而非固定的L形架构或序列基序。任何具有凸起连接的双茎结构都可能成为底物，这可能导致大量m⁵C位点，但mRNA的动态结构、蛋白质保护和亚细胞定位可能阻止这种情况。

**5. mRNA m⁵C读取器**
通过RNA pull-down实验，ALYREF/THOC4被鉴定为最可能的m⁵C读取器候选。ALYREF是转录/输出（TREX）复合物的组分，参与mRNA输出，其结构中具有特征性的RNA识别基序（RRM）。m⁵C残基可能促进蛋白与RNA的结合。另一个候选读取器是YBX1，一种主要的RNA结合蛋白，其对含m⁵C的RNA六聚体具有约四倍更高的亲和力。空间结构分析显示，m⁵C基团与YBX1冷休克结构域（CSD）中的W65残基堆叠，形成更强的疏水相互作用。YBX3 CSD也表现出对m⁵C RNA的更高亲和力。然而，m⁵C残基在mRNA中出现的频率极低（约几千分之一），这些蛋白对m⁵C区域的亲和力仅比未修饰区域高几倍，如何区分这些mRNA仍不清楚。一种可能的解释是，YBX1以协同方式结合mRNA，初始结合能促进后续蛋白多聚化，从而在m⁵C位点获得优势。ALYREF作为TREX复合物的一部分，可能特异性不高，但在游离状态下可能具有特异性。

**6. mRNA m⁵C擦除器**
在DNA中，m⁵C表观遗传标记由TET1-3家族和ALKBH1去除，它们通过逐步氧化生成hm⁵C、f⁵C和ca⁵C，随后通过碱基切除修复（BER）替换。这些脱氧酶多数具有核定位，部分也存在于线粒体或细胞质。一些蛋白也能去除单个RNA中的m⁵C修饰（更准确说是“转换”）。例如，TET2氧化tRNA中的m⁵C为hm⁵C，ALKBH1氧化mt-tRNA^Met中由NSUN3甲基化的C34为f⁵C。如果这些擦除器对mRNA具有特异性，则可能发生在mRNA输出到细胞质之前。然而，BER机制不适用于mRNA，且f⁵C和hm⁵C在mRNA中的水平极低，表明m⁵C从mRNA的去除过程很可能是背景性的，对mRNA生物发生贡献不大。

**7. m⁵C mRNA甲基化的生物学相关性**
对mRNA特异的m⁵C甲基转移酶缺乏或活性抑制会导致细胞转录组和翻译组的全局紊乱，其基因突变与神经退行性疾病和智力障碍相关。NSUN2基因的多种突变已在常染色体隐性智力障碍患者中描述，果蝇中NSUN2缺乏也会导致认知障碍。m⁵C mRNA甲基化与癌变也有关联。然而，这些酶的关键功能是tRNA/vtRNA甲基化还是mRNA甲基化尚不清楚。tRNA的半衰期很长，而mRNA更短，因此甲基转移酶失活对转录组的影响更可能通过mRNA介导。此外，酶对特定mRNA的特异性可能解释其在神经退行性疾病中的作用。m⁵C修饰在mRNA中的水平很低，平均每个mRNA仅含一个或几个修饰位点。这引发若干问题：单个甲基能否显著影响mRNA功能？该修饰是否仅对特定mRNA或特定细胞类型/分化阶段重要？修饰位置是否重要？分析显示m⁵C位点普遍存在于5′-UTR、3′-UTR和CDS，但更倾向于位于5′-UTR和起始密码子附近。然而，这些位点并非进化保守，不同物种间不共享，保守性较低。许多研究表明，m⁵C甲基化mRNA在NSUN2缺乏时稳定性降低，过表达时稳定性增加，且这种效应常与读取器蛋白ALYREF、YBX1和YBX3相关。但m⁵C残基如何物理上降低降解的具体机制仍不清楚。m⁵C甲基化与翻译效率的关联也不明确，可能通过影响mRNA稳定性间接实现。NSUN6的甲基化位点主要位于3′-UTR近终止密码子处，可能增强翻译终止保真度。m⁵C残基在CDS中可能影响核糖体解码过程，但程度尚需澄清。总之，NSUN2和NSUN6无疑调控mRNA功能，但这是否直接与m⁵C修饰相关，还是主要归因于甲基转移酶的RNA结合特性，仍有待阐明。

**8. 结论与展望**
尽管对m⁵C mRNA甲基化有浓厚兴趣并取得进展，但许多问题仍未解决。主要原因包括：第一，需提高m⁵C位点检测精度，严格排除假信号，并获取不同细胞类型和组织中的信息。高通量纳米孔测序（nanopore sequencing）可能解决此问题。第二，在研究m⁵C RNA甲基转移酶在细胞过程中的作用时，需区分其作为酶和作为RNA结合蛋白的功能。使用催化失活的甲基转移酶突变体以及表达单个mRNA的核苷酸替换突变体可能阐明此问题。第三，需记住m⁵C RNA甲基转移酶是小RNA加工的必要参与者，消除其催化功能会不可避免地扭曲mRNA的结果。鉴定NSUN2在mRNA上的结合位点并在体外合成RNA底物上建模甲基转移酶功能可能有助于解决这些问题。不弄清上述原因，将难以回答为什么m⁵C甲基转移酶（特别是NSUN2）的缺乏会导致神经病理学这一根本问题。